4. Микробиологические исследования позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме возбудителей инфекционных заболеваний. Также такой анализ является эффективным способом выявления уровня чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам.

Материалом для проведения тестов могут быть биологические жидкости, плотные фрагменты кала, мазки из слизистых оболочек, тканевые биоптаты, полученные посредством эндоскопических или других инвазивных обследований. В целях достоверности полученных результатов, микробиологические методы исследования отводят важное значение вопросам правильного и своевременного забора материала на анализ. В ряде случаев, забор биоматериала выполняется врачом, но сбор кала и мочи производится пациентом самостоятельно. Все тонкости процедуры специалист нашей клиники изложит в доступной форме. Взятие кала, мочи, а также других материалов для исследований, производится в специальную стерильную посуду.

Классические микробиологические методы исследования решают задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией по биохимическим, антигенным и ряду других признаков. Полноценный анализ предъявляет достаточно жесткие требования к качеству исходного материала, а также срокам его транспортировки и хранения. Именно по этой причине, биоматериал, который сдает пациент, максимально оперативно попадает на изучение в лабораторию, что гарантирует получение достоверного и актуального для назначения эффективного лечения результата.

Микробиологические методы исследования:

 

Микробиология оперирует 4-мя базовыми методами диагностики: микроскопическим, культуральным, биологическим и иммунологическим.

а) микроскопическая диагностика базируется на микроскопии мазка, который приготавливается из патологического материала (крови, мочи, раневого отделяемого и др.) с целью обнаружения в нём тех или иных микроорганизмов.

б) культуральный метод предполагает выделение из материала чистой культуры микроорганизма и ее дальнейшую идентификацию.

в) биологическая или экспериментальная диагностика основывается на введении патологического биоматериала в организм лабораторного животного. В случае, когда в материале присутствует патогенный микроорганизм, лабораторное животное заболевает. При необходимости аспекты биологической диагностики сочетаются с другими методами.

г) совокупностью способов изучения объекта исследования отличается иммунологический метод, основывающийся на анализе серологических реакций.

Таким образом, микробиологические исследования оперируют широким арсеналов методов, позволяющих получать точные результаты изучения биоматериала.

6.Принципы систематики прокариот

Вначале основное внимание уделяли морфологическим признакам бактерий. Так, в 1872 г. Ф.Кон (F.Cohn, 1828-1898) разделил бактерии на группы по морфологическим признакам: кокки, короткие палочки, удлиненные палочки, спирали. Однако вскоре стало ясно, что морфологические признаки недостаточны для удовлетворительного распределения бактерий по таксономическим группам. Для этой цели стали привлекать физиологические признаки. В 1909 г. С.Орла-Йенсен (S.Orla-Jensen) сделал попытку классифицировать бактерии на основе известных к тому времени физиологических признаков. Важным шагом в развитии систематики прокариот явилось использование признаков, дающих информацию о химическом строении клетки: состав оснований ДНК, ДНК-ДНК-гомологии и ДНК-РНК-гомологии, аминокислотная последовательность белков, строение рибосом, компонентов клеточной стенки и т.д. Первые предложенные схемы классификации бактерий были крайне субъективны. Это привело группу систематиков бактерий к использованию иного подхода для определения степени сходства между прокариотами - нумерической систематики. В основе ее лежат идеи, сформулированные в середине XVIII в. французским ботаником М.Адансоном (М.Adanson, 1727-1806): все признаки объекта считаются равноценными; при описании исследуемого объекта используется максимальное количество признаков, которые могут быть изучены и определены; степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства. Последний дя двух сравниваемых штаммов получают путем определения отношения числа одинаковых признаков к общему числу изученных признаков. Значение коэффициента сходства меняется в диапазоне от 1 (полная идентичность) до 0 (несовпадение ни по одному изученному признаку). Наиболее полно задача быстрой идентификации прокариотных организмов решается с помощью Определителя бактерий Берги, выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X.Берги (D.H.Bergey, 1860-1937); девятое издание в 4 томах вышло в 1984-1989 гг. В девятом издании Определителя бактерий Берги все обнаруженные организмы, отнесенные в царствоProkaryotae , разделены на 33 группы. Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, как правило, относятся к категории легко определяемых и вынесены в названия групп, например:грамотрицательные аэробные палочки и кокки (группа 4) , анаэробные грамотрицательные кокки (группа 8) , грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры (группа 13) , скользящие бактерии, образующие плодовые тела (группа 24) . Основная идея классификации "по Берги" - легкость идентификации бактерий. Для осуществления этого используют совокупность признаков: морфологических (форма тела; наличие или отсутствие жгутиков; капсулы; способность к спорообразованию; особенности внутриклеточного строения; окрашивание по Граму), культуральных (признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой культуры), физиолого-биохимических (способы получения энергии; потребности в питательных веществах; отношение к факторам внешней среды; нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК; наличие и характер минорных оснований в ДНК; нуклеотидный состав рибосомальной РНК; последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями).

Для девятого издания Определителя бактерий Берги характерен отказ от построения классической иерархической системы классификации. Она заменена списком упомянутых выше групп и сохранилась только фрагментами. Ценность Определителя в том, что он представляет собой наиболее полную сводку известных бактериальных форм и самое современное пособие для идентификации бактерий.

В этом же руководстве предложена схема деления царства Prokaryotae на высшие таксоны (отделы, классы). В основу деления на отделы положено строение клеточной стенки. - Отдел I (Gracilicutes) включает организмы с разной морфологией, имеющие грамотрицательную клеточную стенку. Размножение в основном бинарным делением, в некоторых группах - почкованием, в одной - множественным делением. Спор не образуют. Многие подвижны с помощью жгутиков или скольжения. Аэробные, анаэробные или факультативно анаэробные формы. Отдел подразделяется на 3 класса, объединяющие нефотосинтезирующие организмы ( Scotobacteria ) и фотосинтезирующие организмы ( Anoxyphotobacteria , Oxyphotobacteria ).

- В отдел II (Firmicutes) входят организмы с грамположительной клеточной стенкой. Размножаются в основном бинарным делением. Некоторые образуют эндоспоры. У других споры на гифах или в спорангиях. Перемещаются с помощью жгутиков. Большинство неподвижны. В состав отдела входят аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные формы. В зависимости от морфологии предложено деление на 2 класса: Firmibacteria (кокки, палочки, неветвящиеся нити) и Thallobacteria (ветвящиеся формы).

- К отделу III (Tenericutes) относятся прокариоты, у которых отсутствует клеточная стенка и не синтезируются предшественники пептидогликана. Клетки окружены ЦПМ , чрезвычайно плеоморфны. Размножение бинарным делением, почкованием, фрагментацией. Окрашивание по Граму отрицательное. Характерно образование мелких, врастающих в агар колоний. Могут быть сапрофитами , паразитами или патогенами. Представлены одним классом Mollicutes .

- В отделе IV (Mendosicutes) объединены прокариоты, по имеющимся данным, претендующие на более раннее происхождение, чем формы, включенные в I и II отделы. Клетки разной формы: кокки, палочки, нити. Многие плеоморфны. Большинство имеют клеточную стенку, но она не содержит типичногопептидогликана . Клеточная стенка может быть построена только из белковых макромолекул или гетерополисахаридов. Окрашивание по Граму отрицательное или положительное. Большинство - строгие анаэробы. Многие имеют жгутики. Характеризуются экологическим и метаболическим разнообразием, способностью жить в экстремальных условиях. Объединены в класс Archaeobacteria .

Представленная в Определителе бактерий Берги система классификации является строго идентификационной и не решает задачи выявления эволюционных связей между прокариотами. В то ж время конечной целью является построение такой системы, в основе которой лежали бы родственные связи между прокариотными организмами. Первая попытка в этом направлении при надлежит С.Орла-Йенсену, предложившему филогенетическую систему бактерий, основанную на физиологических признаках С.Орла-Йенсен исходил при этом из предположения, что, поскольку на первобытной Земле отсутствовало органическое вещество, первые бактерии должны были быть автотрофами . В качестве самых примитивных бактерий он рассматривал аэробные бактерии, окисляющие метан. Позднее такие попытки предпринимались крупнейшими микробиологами А.Клюйвером, К. ван Нилем, Р.Стейниером.

Более тонкий метод оценки генетического сходства организмов - сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК из разных источников методом ДНК-ДНК-гибридизации. Метод наиболее полезен для классификации на уровне вида, т.е. в случае высокой степени гомологии, и мало информативен для классификации объектов на уровне высоких таксонов Помимо анализа молекул ДНК для установления степени родства между прокариотными организмами разработаны методические подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Это могут быть белки (ферредоксины, цитохромы и др.) или рРНК.

Известно, что в рибосомах прокариот и эукариот присутствуют З типа рРНК, различающихся молекулярной массой и коэффициентом седиментации. Информационная емкость крупных молекул больше, но их труднее анализировать. Поэтому наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 16S (у прокариот) и 18S (у эукариот), состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов соответственно. К настоящему времени последовательности 16S и 18S рРНК изучены более чем у 400 организмов, принадлежащих к разным царствам живой природы. На основании полученных данных рассчитаны коэффициенты сходства сравниваемых организмов, что привело к неожиданным результатам: выявлены не две группы организмов, различающихся прокариотным и эукариотным типом клеточной организации, а три. Одну образуют все эукариоты : высшие растения, животные, дрожжи, водоросли и т.п. В эту группу не вошли органеллы эукариот ( митохондрии , хлоропласты ). Таким образом, первая группа представлена ядерно- цитоплазматическим компонентом эукариотных клеток. Ко второй группе, получившей название истинных бактерий, или эубактерий , относится подавляющее большинство прокариот. Сюда же попали на основании степени гомологии 16S рРНК митохондрии ихлоропласты эукариотных клеток. Наконец, в третью группу вошли некоторые малоизученные прокариоты, обитающие в экстремальных условиях: метанобразующие бактерии , экстремальные галофилы и термоацидофилы . Эта группа организмов получила название архебактерий .

Хотя клетки архебактерий структурно относятся к прокариотному типу, они построены из макромолекул (липидов, полисахаридов, белков), многие из которых являются уникальными и не синтезируются ни эукариотами, ни эубактериями. Архебактерии осуществляют ряд биохимических процессов, не свойственных остальным живым организмам. На основании этого был сделан вывод, что архебактерии, по-видимому, представляют собой одну из самых древних групп живых существ.

Обнаружение в недрах мира прокариот группы архебактерий поставило заново вопрос о путях клеточной эволюции с момента возникновения некоей гипотетической первичной клетки.

Традиционная общая схема клеточной эволюции основываете на следующих предположениях: из популяции первичных клеток в результате целого ряда событий, приведших к повышению уровня клеточной организации, под давлением естественного отбора возникла популяция предковых прокариотных клеток, из которых в конечном итоге произошли разные группы прокариот. Маловероятно, чтобы предковые прокариотные клетки все были "на одно лицо". Единственная их общая черта - прокариотная организации ( табл. 1 ). Эукариотная клетка возникла в результате эндосимбиоза, в котором ядерно-цитоплазматическим компонентом, т.е. клеткой-хозяином, и эндосимбионтами, превратившимися впоследствии в митохондрии и хлоропласты, были существенно различающиеся между собой прокариотные клетки ( рис. 41 , А). Следствием такого взгляда на общий ход эволюции явилось признание двух основных царств живых организмов - Prokaryotae и Eukaryotae.

Новая схема клеточной эволюции исходит из признания сущетвующих трех фундаментально различающихся типов живых организмов: эубактерий, архебактерий и эукариот. Согласно этой схеме от общего гипотетического предка, получившего название " прогенота ", эволюционировали три различные ветви прокариот: эубактерии , архебактерий и уркариоты ( рис. 41 , Б). Уркариоты представлены ядерно-цитоплазматическим компонентом эукариотной клетки, включившим в себя в качестве эндосимбионтов представителей разных групп эубактерий, превратившихся в митохондрии и хлоропласты .

По целому ряду свойств на молекулярном уровне, и прежде всего по анализу 16-18S рРНК, выявленные три группы живых организмов значительно различаются между собой, что привело исследователей к выводу о приблизительно одинаковом "эволюционном" расстоянии между ними. На основании анализа 16S рРНК сделаны также первые попытки выяснить филогенетические взаимоотношения в группе эубактерий. Все изученные эубактерий в соответствии с вычисленными коэффициентами сходства оказались распределенными на 10 эволюционных ветвей. Наиболее неожиданный результат - обнаружение фотосинтезирующих эубактерий в 5 ветвях из 10, позволяющее сделать заключение о большем их родстве с определенными нефотосинтезирующими бактериями, чем между собой. Это позволяет по-новому подходить к проблеме происхождения разных видов фотосинтеза и фотосинтезирующих эубактерий.

Таким образом, в настоящее время отсутствует сколько-нибудь детализированная эволюционная система прокариот. Все описанные выше попытки подойти к ее созданию позволяют сделать вывод о том, что решение этой проблемы - дело неблизкого будущего. Особенности прокариот в области морфологической, физиолого-биохимической, генетической организации говорят о неприменимости к ним хорошо разработанных принципов, используемых при построении системы высших организмов. Это, естественно, значительно усложняет задачу, но не делает ее безнадежной. Уже сейчас в мире прокариот для наиболее изученной части этих организмов - эубактерий - можно проследить основные направления эволюционного развития. Одна из многообещающих идей заключается втом, что в основе прогрессивной эволюции эубактерий лежит совершенствование способов получения ими энергии.

Штамм (от нем. Stamm, буквально — «ствол», «основа») — чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и в определённом месте. Поскольку многие микроорганизмы размножаются митозом (делением), без участия полового процесса, по существу, виды у таких микроорганизмов состоят из клональных линий, генетически и морфологическиидентичных исходной клетке. Штамм не является таксономической категорией, наинизшим таксоном у всех организмов является вид, один и тот же штамм не может быть выделен второй раз из того же источника в другое время.^[1]

клон – группа клеток, которые происходчт от одной клетки путем бесполого размножения и поэтому появляются генетически идентичные друг другу родительской клетке.

Чи́стая культу́ра (или аксеничная культура) — совокупность микроорганизмов одного вида, имеющие одинаковые морфологические, биохимичес

7. В микробиологии, как и в биологии, для обозначения вида бактерий принята двойная (бинарная) номенклатура, предложенная еще в XVIIIв К.Линяеем. Первое слово пишется с прописной латинской буквы и обозначает род, характеризующий какой-либо морфологический или физиологический признак либо фамилию ученого, открывшего этот микроб. Второе слово - вид - пишется со строчной буквы и представляет собой производное от существительного, дающего описание цвета колонии, источника происхождения микроорганизма, вызываемого им процесса или болезни и некоторые другие отличительные признаки. Например, Escherichia coli указывает, что микроб открыл Эшерих, соli — обитатель кишечника; Bacillus anthracis - микроб образует спору, anthracis - возбудитель сибирской язвы. Azotobacter - микроорганизм, фиксирующий атмосферный азот.

Основной номенклатурной единицей является вид. В.Д.Тимаков (1973) дает ему следующее определение; «Вид - это совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение и генотип, сходных по морфологическим и биологическим свойствам, обладающих наследственно закрепленной способностью вызывать в среде естественного обитания качественно определенные специфические процессы». Вид подразделяется на подвиды или варианты. При изучении выделенных бактерий часто обнаруживают отклонения от типичных видовых свойств, такую культуру рассматривают как подвид. Имеются также и инфраподищноеые подразделения, которые основаны на отличии особей каким-либо небольшим наследственным признаком: антигенным - серовар, биохимическим-биовар, отношением к фагам — фаговар, патогенностью - патовар и др.

Введение в слова общей части «вар» (вариант) рекомендовано во избежание возможных недоразумений, ранее применявшийся термин «тип» использован для обозначения номенклатурного типа.

В микробиологии используют термин «штамм» и «клон». Штамм - культура одного и того же вида, выделенная из разных объектов и отличающаяся незначительными изменениями свойств (например, чувствительностью к антибиотикам, ферментацией углеводов и др.). Под термином «культура» понимают микроорганизмы, выращенные на плотной или жидкой питательной среде в условиях лаборатории. Клон — это культура, полученная из одной клетки. Культуру микроорганизмов, содержащую особи одного вида, называют чистой культурой. Смешанной культурой называют взвесь, содержащую различные виды микроорганизмов, выделенных из исследуемого материала (молока, мяса, почвы, воды).

В микробиологии существует два различных подхода к систематике, обуславливающие два вида классификации. В основе первого лежит идея создания естественной (филогенетической) классификации прокариот, то есть построения единой системы, объективно отражающей родственные отношения между разными группами и историю их эволюционного развития. Второй подход к систематике преследует практические цели и служит для идентификации, то есть установления принадлежности микроорганизма к определенному виду. Это искусственная классификация (традиционная). Современные системы классификации микроорганизмов, по существу, являются искусственными. Этому служат определители, которыми пользуются главным образом при идентификации того или иного микроорганизма. К таким определителям относятся: «Определитель бактерий и актиномицетов» Н.Л.Красильникова (1949), «Определитель микробов» РА.Циона (1948) и др. К международным определителям бактерий относится «Руководство по систематике бактерий» Д.Х.Берджи, девятое издание которого вышло в 1997г. В этом определителе все прокариотические микроорганизмы объединены в царство Procaryotae (Murray,1968), которое подразделяется на четыре отдела. Они, в свою очередь, делятся на секции, классы, порядки, семейства, роды, виды.