2.2. Определение количественного содержания витаминов а и е в морепродуктах

Определение количественного содержания витаминов А и Е проводилось на образцах четырех видов замороженных морепродуктов (креветка, осьминог, кальмар, мидия) и трех видах замороженной морской рыбы (минтай, путассу, камбала). Исследовали по пять параллельных образцов каждого объекта, в которых определяли содержание витаминов А и Е.

Методика определения количественного содержания витаминов А и Е.

В центрифужные пробирки помещается растертое мясо морепродукта (навеска 1 г), 1 мл спирта и 1 мл дистиллированной воды. Пробирки закрывают крышками и перемешивают содержимое осторожными встряхиваниями. Затем добавляют по 5 мл гексана и еще раз производят встряхивание. Затем центрифугируют в течении 10 минут при 1500 об/мин.

Четко отделившийся гексановый слой используют для проведения измерений.

Определение содержания витаминов А и Е проводили на анализаторе «Флюорат».

Градуировку прибора «Флюорат» осуществляли путем измерения сигналов флуоресценции, приготовленных растворов. Контроль стабильности градуировочной характеристики состоит в проведении измерений концентрации витаминов в нескольких смесях. Градуировка признается стабильной, если полученное значение концентрации витаминов в смеси отличается от известного не более, чем на 10% в диапазоне 0,5 -2,0 мг/дм³ и 20% при более низких концентрациях. При несоответствии полученных результатов указанным нормативам процесс градуировки необходимо повторить.

В основу работы прибора положен флуориметрический метод измерения содержания органических и неорганических веществ в области спектра 250-900 нм (например, витамин Е диапазон 300-320 нм). Для анализа использовались кюветы 10х20 мм. Во время работы на «Флюорате» необходимо выбрать из меню необходимую методику, затем измерить фоновый сигнал, после установить кювету с пробой и запустить процесс измерения.

В качестве светофильтров при измерения витамина Е применяют светофильтр возбуждения Е-1 (292 нм) и светофильтр регистрации Е-2 (320 нм). В качестве светофильтров при анализе витамина А используют светофильтр возбуждения А-1 (335)нм) и светофильтр регистрации А-2 (460 нм).

Этот метод определения содержания витаминов был выбран в связи с наличием необходимого оборудования и простотой использования.

3. Определение содержания диеновых конъюгатов в морепродуктах

Помимо того что о антиоксидантной активности морепродуктов можно судить по содержанию витаминов А и Е так и по содержанию диеновых конъюгатов.

К первичным продуктам перекисного окисления липидов относятся циклические эндоперекиси и алифатические моно- и гидроперекиси, так называемые липопероксиды и диеновые конъюгаты [25].

Определение диеновых конъюгатов имеет значительное преимущество для оценки ПОЛ, поскольку отражает раннюю стадию окисления. Обычным субстратом для определения диеновых конъюгатов выступает любое вещество, содержащее полиненасыщенные жирные кислоты.

Свободнорадикальное, или перекисное, окисление липидов (ПОЛ) представляет собой самоподдерживающуюся цепную реакцию, продукты которой в умеренных количествах необходимы для осуществления таких функций организма, как обновление биологических мембран, фагоцитоз, регуляция артериального давления и т.д., но в больших — вредны, поскольку нарушают структуру клеточных мембран [26].

При свободнорадикальном окислении арахидоновой кислоты происходит отрыв водорода в α-положении по отношению к двойной связи, что приводит к перемещению этой двойной связи с образованием ДК [27].

Диеновые конъюгаты относятся к токсическим метаболитам, которые оказывают повреждающее действие на липопротеиды, белки, ферменты и нуклеиновые кислоты [28].

Определение диеновых конъюгатов имеет значительное преимущество для оценки ПОЛ, поскольку отражает раннюю стадию окисления. Обычным субстратом для определения диеновых конъюгатов выступает любое вещество, содержащее полиненасыщенные жирные кислоты.

Диеновые конъюгаты обладают поглощением в УФ-области (λ = 232 нм), коэффициент молярной экстинкции 2,2∙10⁵ см^-1 ∙М ^-1 . Пробоподготовка для анализа диеновых конъюгатов обязательно включает в себя экстрагирование липидов органическими растворителями.

а) Экстракция диеновых конъюгатов из сыворотки крови или ткани гептан-изопропанольной смесью, с последующим измерением оптической плотности в гептановой или изопропанольной фазе (λ= 232-234 нм).

б) При анализе с использованием ВЭЖХ, установлено, что диеновые конъюгаты, образующиеся в организме человека, в основном представлены изомерами линолевой кислоты, октодека-9 цис -, транс - диеновой кислоты.

В данной работе степень диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот определяли по методике И.Д. Стальной (1977).

Принцип. Процесс пероксидного окисления полиненасыщенных жирных кислот сопровождается перегруппировкой двойных связей и возникновением системы сопряженных диеновых структур, имеющих максимум поглощения при 232—234 нм с плечом в области 260—280 нм, соответствующим сопряженным кетодиенам. 

Реактивы:

1. гептанн

2. изопропанол

3. этиловый спирт

Ход исследования:

Для определения диеновых конъюгатов 300 мг мяса морской рыбы гомогенизировали с 3 мл смеси гептан:изопропан в соотношении 1:1 и центрифугировали 10 мин при 6000 об/мин. К супернатанту добавили 0,25 мл воды. К 0,5 мл гептановой фазы добавили 2,5 мл этилового спирта. Оптическую плотность измеряют при λ=233нм против контроля (гептан:изопропан 1:1) [29].

В ходе ПОЛ на стадии образования свободных радикалов в молекулах НЖК возникает система сопряженных двойных связей, что сопровождается появлением нового максимума в спектре поглощения при 233 нм.

Расчет ДК производили по формуле:

ДК=Д233/(Е*с)

где Д233 - оптическая плотность;

Е - коэффициент молярной экстинкции, 2,2*10⁵см^-1*М^-1;

С - концентрация липидов, мг / мл.

Диеновые конъюгаты выражали в мкмоль ДК/мг липидов.