Зависимость скорости реакции от температуры

А Б

Рис. 4. Зависимость скорости реакции от рН (А) и температуры (Б).

Скорость химической реакции повышается в 2 раза при повышении температуры на 10С. Однако вследствие белковой природы фермента при дальнейшем повышении температуры наступает денатурация фермента. Температура, при которой скорость реакции максимальна, называется температурным оптимумом (рис. 4, Б). Для большинства ферментов оптимум температуры составляет 37-40С. Некоторые ферменты термостабильны. Например, миокиназа мышц, которая выдерживает нагревание до 100С.

Ключевое значение для широкого распространения метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в медицине и биологии имеет использование термостабильного фермента ДНК-полимеразы, полученной из термофильных бактерий.

Активаторы

Активаторы ферментов – это вещества 1) формирующие активный центр фер­мента (Co²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Са²⁺); 2) облегчающие образование фермент-суб­стратного комплекса (Мg²⁺); 3) восстанавливающие SH-группы (глутатион, цисте­ин, меркаптоэтанол); 4) стабилизирующие нативную структуру белка-фермента. Активируют ферментативные реакции обычно катионы (в таблице Менделеева с 19 по 30). Анионы менее активны, хотя ионы хлора и анионы некоторых других галогенов могут активировать пепсин, амилазу, аденилатциклазу. Активаторами могут быть белки: апопротеин А-I (лецитин-холестеролацилтрансфераза - ЛХАТ), апопротеин С-II (липопротеинлипаза - ЛПЛ), вторичные внутриклеточные посредники.

Ингибиторы

Ингибиторы ферментов – это соединения, которые взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию нормального фермент-субстратного комплекса, уменьшая тем самым скорость реакции или прекращая ее.

Ингибиторы делят на две группы - неспецифические и специфические. Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию белка-фермента (соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи и др.) и их действие не связано с механизмами ферментативного катализа. Действие специфических ингибиторов связано с механизмами ферментативного катализа. Специфические ингибиторы делятся на 2 группы: необратимые и обратимые.

При необратимом ингибировании происходит непрерывная модификация молекул фермента, в результате чего фермент частично или полностью теряет свою активность. Такое действие оказывают вещества, которые прочно и необратимо связывают функциональные группы активного центра или препятствуют изменению валентности металла активного центра. К ним относятся:

1) ингибиторы металлосодержащих ферментов (HCN, RCN, HF, CO и др.). Эти соединения связываются с металлами с переменной валентностью (Cu или Fe), в результате чего нарушается процесс переноса электронов по дыхательной цепи ферментов. Поэтому эти ингибиторы называются дыхательными ядами.

2) ингибиторы ферментов, содержащих SH-группы (монойодацетат, дийодацетат, йодацетамид, соединения мышьяка и ртути).

3) ингибиторы ферментов, содержащих ОН-группу в активном центре (фосфороорганические соединения, инсектициды). Эти ингибиторы тормозят, прежде всего, активность холинэстеразы – фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.

Обратимое ингибирование поддается количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные.

Конкурентные ингибиторы – это молекулы, настолько похожие на молекулы субстратов реакций, что ферменты «не могут их различить». В результате связывания конкурентного ингибитора с активным центром фермента уменьшается количество истинных фермент-субстратных комплексов и падает скорость катализируемой реакции. Классическим примером конкурентного ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. Сукцинатдегидрогеназа катализирует окисление янтарной кислоты (сукцината) путем дегидрирования в фумаровую кислоту.

Если в среду добавить малоновую кислоту (ингибитор), то в результате структурного сходства с истинным субстратом - сукцинатом он будет реагировать с активным центром и образовывать фермент-ингибиторный комплекс, который не может подвергаться дальнейшим превращениям. Связывание конкурентного ингибитора не приводит к повреждению структуры активного центра фермента. Действие такого ингибитора устраняется путем увеличения концентрации субстрата. Таким образом, конкурентный ингибитор дает эффект «разбавления» субстрата. Поэтому при конкурентном ингибировании увеличивается значение Кm (концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной), но величина V_max остается постоянной (рис. 5).

Рис. 5. Влияние конкурентных ингибиторов на скорость ферментативной реакции

Метод конкурентного ингибирования нашел применение в медицинской практике, в виде использования антиметаболитов. Многие лекарственные вещества ингибируют ферменты человека и животных по конкурентному типу. Примером являются сульфаниламидные препараты, которые имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой (ПАБК).

Бактериальная клетка использует ПАБК для синтеза фолиевой кислоты, необходимой для образования нуклеиновых кислот. Благодаря структурному сходству сульфаниламид ингибирует ферменты метаболизма парааминобензойной кислоты, что приводит к снижению синтеза фолиевой кислоты, нуклеиновых кислот и гибели микроорганизма.

Неконкурентные ингибиторы – вещества, не имеющие структурного сходства с субстратами. Неконкурентные ингибиторы связываются не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента, в том числе и в области аллостерического центра. Обратимые неконкурентные ингибиторы понижают V_max за счет уменьшения количества действующих молекул фермента. Ингибиторы этого типа не мешают связыванию субстрата с активным центром сохранившихся молекул фермента, в результате величина K_m не меняется. Механизм ингибирования состоит в снижении скорости реакции за счет уменьшения количества нормальных фермент-субстратных комплексов. Таким образом, при неконкурентном ингибировании: V_max уменьшается, а K_m не изменяется (рис. 6).

Рис. 6. Влияние неконкурентных ингибиторов на скорость реакции.

Чаще встречается смешанный тип ингибирования, когда снижение V_max сочетается с одновременным увеличением K_m. Это означает: при соединении ингибитора с ферментом сохраняется возможность последующего присоединения субстрата с образованием тройного комплекса, что обеспечивает медленное превращению в продукт реакции.

В редких случаях возможно бесконкурентное ингибирование, обнаруживаемое при повышении концентрации субстрата. Один из возможных механизмов этого эффекта связан с соединением ингибитора с фермент-субстратным комплексом, что ведет к образованию неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса.

Специфическую группу ингибиторов ферментов составляют ингибиторы белковой природы. Они блокируют действие фермента за счет белок-белковых взаимодействий, в результате чего закрывается активный центр фермента. Особенно энергично белковые ингибиторы регулируют деятельность протеиназ клетки, поскольку в результате их действия тормозится переход проферментов в ферменты, отщепление сигнальных пептидов и других пептидных фрагментов при созревании белков, блокируются реакции протеолиза, ведущие к образованию биологически активных пептидов.