Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI и Cfr9i

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК pUC19	500 ng/µl	1000 ng	2.0 µl
Буфер Yellow Тango^TM	10 X	1X	2.0 µl
Рестриктаза SmaI	10 u/µl	1 u	0.1 µl
Рестриктаза Cfr9I	10 u/µl	4 u (4Х)	0.4 µl
H₂O		до 20 µl	15.5 µl
Условия реакции: 30 °C 1 час, 37 °C 1,5 часа. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 °С.

Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фермента t4 днк полимеразы.

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК вставки	80 ng/µl	1000 ng	12.5 µl
5Х reaction buffer	5 X	1X	4.0 µl
dNTP, 2mM each	2 mM	0.1 mM (каждого dNTP)	1.0 µl
T4 DNA polymerase	5 u/µl	1 u	0.2 µl
H₂O		до 20 µl	2.3 µl
Условия реакции: 5 минут при комнатной температуре (22 ^оС) Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С.

Суммарное количество ДНК в лигазной смеси – 200 ng

Отношение вектор/вставка = 1/3

Пусть x – масса вектора в ng, у – масса вставки в ng.

x+y=200 (y/1200)/(x/2686)=3

x=200-y y/1200=3*(200-y)/2686

y=114.5 нг x=85.5 ng

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК вставки	50 ng/µl	114.5 ng	2.3 µl
ДНК вектора	50 ng/µl	85.5 ng	1.7 ng
10x Ligation Buffer	10X	1X	2.0 µl
T4 ligase	10 u/µl	5 u	0.5 µl
H₂O		до 20 µl	13.5 µl
Условия реакции: 10 минут при комнатной температуре (22 ^оС). Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 65°С.

<<< < Предыдущая 1 2 3 45 / 55

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]