- •Лигирование вектора со вставкой
- •Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI.
- •Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фрагмента Клёнова.
- •Лигирование вектора со вставкой
- •Протокол рестрикции pUc19 с HindIii и SmaI.
- •Протокол лигирование вектора со вставкой
- •Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI
- •Лигирование вектора со вставкой
- •Протокол лигирование вектора со вставкой
- •Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI и BamHi
- •Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фрагмента Клёнова.
- •Лигирование вектора со вставкой
- •Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI и PstI
- •Лигирование вектора со вставкой
- •Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI и Cfr9i
- •Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фермента t4 днк полимеразы.
- •Лигирование вектора со вставкой
Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фрагмента Клёнова.
Наименование реагента |
Исходная концентрация |
Желаемое количество/концентрация в конечном растворе |
Объем реактива (добавляемый в пробирку) |
ДНК вставки |
80 ng/µl |
1000 ng |
12.5 µl |
10Х reaction buffer |
10 X |
1X |
2.0 µl |
dNTP, 2mM each |
2 mM |
0.1 mM (каждого dNTP) |
0.5 µl |
Klenow Fragment |
10 u/µl |
1 u |
0.1 µl |
H2O |
|
до 20 µl |
4.9 µl |
Условия реакции: 10 минут при 37 оС. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. |
|||
Лигирование вектора со вставкой
Суммарное количество ДНК в лигазной смеси – 200 ng
Отношение вектор/вставка = 1/3
Пусть x – масса вектора в ng, у – масса вставки в ng.
x+y=200 (y/1200)/(x/2686)=3
x=200-y y/1200=3*(200-y)/2686
y=114.5 нг x=85.5 ng
Наименование реагента |
Исходная концентрация |
Желаемое количество/концентрация в конечном растворе |
Объем реактива (добавляемый в пробирку) |
ДНК вставки |
50 ng/µl |
114.5 ng |
2.3 µl |
ДНК вектора |
50 ng/µl |
85.5 ng |
1.7 ng |
10x Ligation Buffer |
10X |
1X |
2.0 µl |
T4 ligase |
10 u/µl |
5 u |
0.5 µl |
H2O |
|
до 20 µl |
13.5 µl |
Условия реакции: 10 минут при комнатной температуре (22 оС) Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 65°С. |
|||
3) ScaI + PstI
Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI и PstI
Наименование реагента |
Исходная концентрация |
Желаемое количество/концентрация в конечном растворе |
Объем реактива (добавляемый в пробирку) |
ДНК pUC19 |
500 ng/µl |
1000 ng |
2.0 µl |
Буфер Yellow ТangoTM |
10 X |
1X |
2.0 µl |
Рестриктаза SmaI |
10 u/µl |
1 u |
0.1 µl |
Рестриктаза PstI
|
10 u/µl |
1 u |
0.1 µl |
H2O |
|
до 20 µl |
15.8 µl |
Условия реакции: 30 °C 1 час, 37оС 1,5 часа Для инактивации ферментов можем использовать переосаждение ЭДТА |
|||
Лигирование вектора со вставкой
Суммарное количество ДНК в лигазной смеси – 200 ng
Отношение вектор/вставка = 1/3
Пусть x – масса вектора в ng, у – масса вставки в ng.
x+y=200 (y/1200)/(x/2686)=3
x=200-y y/1200=3*(200-y)/2686
y=114.5 нг x=85.5 ng
Наименование реагента |
Исходная концентрация |
Желаемое количество/концентрация в конечном растворе |
Объем реактива (добавляемый в пробирку) |
ДНК вставки |
50 ng/µl |
114.5 ng |
2.3 µl |
ДНК вектора |
50 ng/µl |
85.5 ng |
1.7 ng |
10x Ligation Buffer |
10X |
1X |
2.0 µl |
T4 ligase |
10 u/µl |
5 u |
0.5 µl |
H2O |
|
до 20 µl |
13.5 µl |
Условия реакции: 10 минут при комнатной температуре (22 оС) Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 65°С. |
|||
4) Cfr10I + PvuI