Добавил:

Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Белорусский государственный университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Шонина 04.doc

Скачиваний:

Добавлен:

01.07.2025

Размер:

244.22 Кб

Скачать

☆

1 / 51 2 3 4 5 > Следующая >>>

ФИО	Шонина Мария Юрьевна
Занятие №	4	Дата:	2013.11.4
Тема занятия	Ферменты рестрикции: параметры и условия работы
Вариант	2
№ PC	11

Задание 1

Исходные данные:

Концентрация ДНК pUC19 500 ng/µl, для рестрикции используем 1000 ng;

Рекомендуемый объем реакционной смеси 20 µl;

Размер фрагмента для клонирования - 1200 п.н., концентрации 80 ng/µl.

1) GsuI + BglII

Протокол рестрикции вектора pUC19 ферментом SmaI и BamHI

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК pUC19	500 ng/µl	1000 ng	2.0 µl
Буфер Yellow Тango^TM	10 X	1X	2.0 µl
Рестриктаза SmaI	10 u/µl	1 u	0.1 µl
Рестриктаза BamHI	10 u/µl	1 u	0.1 µl
H₂O		до 20 µl	15.8 µl
Условия реакции: 30 °C 1 час, 37°C 1,5 часа. Для инактивации ферментов можем использовать переосаждение ЭДТА

Лигирование вектора со вставкой

Суммарное количество ДНК в лигазной смеси – 200 ng

Отношение вектор/вставка = 1/3

Пусть x – масса вектора в ng, у – масса вставки в ng.

x+y=200 (y/1200)/(x/2686)=3

x=200-y y/1200=3*(200-y)/2686

y=114.5 ng x=85.5 ng

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК вставки	50 ng/µl	114.5 ng	2.3 µl
ДНК вектора	50 ng/µl	85.5 ng	1.7 ng
10x Ligation Buffer	10X	1X	2.0 µl
T4 ligase	10 u/µl	5 u	0.5 µl
H₂O		до 20 µl	13.5 µl
Условия реакции: 10 минут при комнатной температуре (22^оС) Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 65°С.

TaiI + EcoR32I

Протокол рестрикции вектора pUc19 ферментом SmaI.

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК pUC19	500 ng/µl	1000 ng	2.0 µl
Буфер Yellow Тango^TM	10 X	1X	2.0 µl
Рестриктаза SmaI	10 u/µl	1 u	0.1 µl
H₂O		до 20 µl	15.9 µl
Условия реакции: 30 °C 1 час. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 °С.

Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фрагмента Клёнова.

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
ДНК вставки	80 ng/µl	1000 ng	12.5 µl
10Х reaction buffer	10 X	1X	2.0 µl
dNTP, 2mM each	2 mM	0.1 mM (каждого dNTP)	0.5 µl
Klenow Fragment	10 u/µl	1 u	0.1 µl
H₂O		до 20 µl	4.9 µl
Условия реакции: 10 минут при 37 ^оС. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С.