3.3. Влияние pgp на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс

Исследование влияния семакса проводились в структурах лобных долей (левая сторона) и в подкорке отдельно для каждого из двух транскриптов гена Cplx2. В таблицах 5 и 6 представлены результаты анализа экспрессии двух вариантов мРНК гена Cplx2 в мозге ишемизированных крыс, получавших PGP, в разное время после окклюзии сонных артерий: через 3, 24 и 72 часа. В качестве контроля использовались данные, полученные от ишемизированных животных, которым вводился физраствор.

При анализе результатов в коре отмечено постепенное снижение уровня содержания транскриптов гена Cplx2: через 3 часа каких-либо существенных изменений по сравнению с контрольным вариантом не обнаруживалось, но через сутки отношение количества мРНК гена Cplx2 у животных, получавших PGP, к таковому у ишемизированных животных, получавших физраствор, составляло 0,6 – 0,7. Через трое суток аналогичное соотношение составляло 0,2, что является статистически значимым результатом. При этом, как и в рассмотренных выше случаях, препарат одинаково влияет на характер изменений экспрессии изученных транскриптов: количество транскриптов Cplx2_v1 и Cplx2_v2 уменьшается примерно в одинаковое количество раз, хотя абсолютное количество транскриптов неодинаково.

В подкорковой области, напротив, количество транскриптов гена Cplx2 в условиях введения PGP увеличивается по сравнению с контрольной группой (и вновь относительное содержание обоих транскриптов изменяется приблизительно одинаково): через 3 часа после операции уровень содержания транскриптов гена Cplx2 у ишемизированных крыс, получавших PGP, составлял 1,7 относительно уровня содержания этих транскриптов у контрольных животных, через 24 часа – 1,4 и 1,3, а через 72 часа – 1,1 и 1,3 (для транскриптов Cplx2_v1 и Cplx2_v2 соответственно).

Если учесть, что при ишемии в коре головного мозга через 24 часа отмечалось значительное снижение, а через 72 часа – значительное повышение содержания транскриптов гена Cplx2 по сравнению с ложнооперированными животными, то влияние семакса и PGP, которые у исследуемых групп сначала очень незначительно снижают уровень экспрессии гена Cplx2, а затем снижают его более резко по сравнению с уровнем экспрессии того же гена у ишемизированных животных, получавших физраствор (у них как раз содержание транскриптов гена по сравнению с нормой увеличивается), то влияние препаратов можно считать нормализующим.

В подкорке колебания уровня экспрессии гена не столь выражены как под влиянием ишемии, так и под влиянием препаратов. Однако и здесь прослеживается нормализующий эффект препаратов: если при ишемии в подкорке содержание транскриптов гена Cplx2 незначительно снижалось по сравнению с ложнооперированной группой, то при введении семакса и PGP оно несколько повышается по сравнению с группой животных с ишемией, получавших физраствор.

Глава 4. Обсуждение результатов

Церебральная ишемия является серьёзным повреждающим фактором, воздействующим на головной мозг. В тканях мозга немедленно нарушается нормальное протекание клеточных реакций из-за недостатка притока кислорода и глюкозы. Изменения на молекулярном и клеточном уровнях, такие как модификация клеточных рецепторов в результате реакций глутамат-кальциевого каскада, являются сигналом к экспрессии генов, обеспечивающих синтез веществ, которые участвуют как в деструктивных, так и в репарационных процессах. Эти сигналы передаются к ядру клетки при помощи вторичных мессенджеров. Анализ экспрессии генов в условиях экспериментальной церебральной ишемии помогает, с одной стороны, оценить, как работает генетический аппарат в условиях нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, а с другой стороны, выяснить, какую роль играет генетический аппарат в процессах деструкции и репарации. Изучение экспрессии генов при введении нейропротекторных препаратов ишемизированным животным позволяет исследовать реакцию генома животных на действие препаратов и оценивать их эффективность.

Для исследования процессов, происходящих в ишемизированной нервной ткани, используются экспериментальные модели ишемии. Существует несколько моделей экспериментальной ишемии мозга. Фокальная ишемия возникает при окклюзии отдельных сосудов мозга крысы (классический модельный объект для подобных исследований) и приводит к локальным нарушениям в определённых участках мозга. Глобальная церебральная ишемия вызывается окклюзией двух общих сонных и двух позвоночных артерий и приводит к обширным, тяжёлым и необратимым изменениям в головном мозге.

Нами была использована экспериментальная модель фокальной ишемии мозга крыс, поскольку окклюзия левой средней мозговой артерии более точно воспроизводит патологические процессы при инсульте [141]. Область ишемического повреждения в этом случае находилась в лобном участке коры (левая сторона). Для оценки влияния ишемии на экспрессию гена Cplx2 в качестве контроля использовались ложнооперированные животные. Это было сделано с целью исключения влияния оперативного вмешательства (повреждение тканей, наркоз, введение препаратов) на экспрессию.

Анализ относительного уровня содержания транскриптов гена Cplx2 проводился через 3 часа, 24 часа и 72 часа. По литературным данным [147], [148], уже через 3 часа после окклюзии в зоне ишемического повреждения появляются участки различной степени поражения. Клетки зоны повреждения находятся в состоянии ишемического шока: можно наблюдать характерное сморщивание нейронов и уплотнение ядер. Кроме того обнаруживаются первые признаки отёка. В это время включаются в работу гены раннего реагирования, к которым, вероятно, не относится Cplx2, о чём свидетельствует отсутствие значительных изменений содержания мРНК как в коре, так и в подкорке. Через 24 часа после операции (время максимального ответа) ядро ишемии окружено пенумброй, в области ядра наблюдаются некроз клеток, вакуолизация и отёк нейропиля (область локализации отростков нервных клеток), иначе говоря, вследствие ухудшения кровотока начинаются и прогрессируют серьёзные изменения на клеточном и тканевом уровнях. Через 72 часа в условиях данной модели в повреждённых тканях наблюдаются репарационные процессы.

Поскольку в развитии ишемического повреждения весьма существенную роль играет глутаматная эксайтотоксичность, обусловленная, в частности, избыточным высвобождением глутамата в составе синаптических пузырьков, а в процессе экзоцитоза непосредственное участие принимают комплексины, можно использовать анализ экспрессии гена Cplx2 в качестве одной из характеристик повреждающего воздействия ишемии на головной мозг, и эффективности лекарственной терапии.

При анализе результатов эксперимента было обнаружено, что через 24 часа после операции количество транскриптов гена в коре ишемизированных крыс резко снижалось: по отношению к контрольной группе (ложнооперированные животные) оно составляло менее чем 0,5 для обоих вариантов транскриптов, что является статистически значимым результатом. Через 72 часа аналогичное соотношение составляло 2,3 – 2,6, что свидетельствует о значительном повышении количества соответствующей мРНК по сравнению с контрольной группой. В подкорке колебания уровня мРНК гена Cplx2 по сравнению с контрольной группой были незначительными для обоих транскриптов, что, по-видимому, связано с тем, что подкорковая область в значительно меньшей степени поражена ишемией (областью поражения в данном эксперименте является левая лобная доля коры).

Семакс в коре головного мозга во всех трёх временных точках незначительно понижал уровень содержания транскриптов гена Cplx2 для обоих транскриптов, но для 3 и 24 часов это понижение не может считаться достоверным. Через 72 часа количество обоих транскриптов в коре у ишемизированных животных, которым вводился семакс, по отношению к контролькой группе (ишемизированные животные, которым вводился физраствор) составляло 0.6, что говорит о том, что препарат, вероятно, может в некоторой степени отсроченно смещать уровень экспрессии гена в коре головного мозга в сторону нормализации (учитывая повышение содержания транскриптов в 2.3 – 2.6 раз в коре ишемизированных животных по сравнению с ложнооперированными). Влияние семакса на экспрессию гена Cplx2 в подкорке оказалось ещё менее выраженным, чем в коре, что также согласуется с локализацией зоны ишемии.

PGP в целом понижает уровень мРНК гена Cplx2 в коре головного мозга ишемизированных крыс. Через 72 часа отношение содержания мРНК у ишемизированных крыс, которым вводился PGP, к содержанию мРНК у контрольной группы (крыс с ишемией, которым вводился физраствор) составляет 0.2, что является статистически значимым результатом. В подкорке PGP, напротив, несколько повышает содержание транскриптов гена Cplx2, особенно через 3 часа, когда отношение содержания транскриптов гена у исследуемой группы к содержанию транскриптов у контрольной группы составляет 1.7. В других временных точках это отношение уменьшается, через 72 часа оно минимально (1.1 – 1.3).

Следует подчеркнуть, что корреляция между количеством мРНК в клетке в какой-либо момент и уровнем экспрессии белка не всегда является прямой. Более низкий уровень содержания мРНК по сравнению с контролем может свидетельствовать как о снижении синтеза мРНК этого гена, так и о более значительной деградации мРНК, например, связанной с высокой скоростью трансляции и последующими процессами посттрансляционной деградации мРНК. В совокупности с неоднозначностью функций комплексинов делать глобальные и однозначные выводы о влиянии ишемии и препаратов на его экспрессию, ограничившись всего лишь сопоставлением уровня мРНК гена Cplx2 у исследуемой группы, с уровнем мРНК того же гена у контрольной группы, вряд ли корректно. Для этого необходимо знать не только колебания уровней мРНК, но и динамику изменений содержания белка. Также ещё предстоит узнать скорость оборота (turnover) как мРНК, так и белка CPLX2. Эти данные помогут правильно интерпретировать полученные результаты.

Эффектом применения препаратов может являться некоторое усиление экзоцитоза у клеток нервной ткани, которое сопровождается снижением мРНК гена Cplx2. Причём это может быть выброс как нейротрансмиттеров (не обязательно возбуждающих), так и других активных молекул, например, факторов роста. Положительное влияние семакса и PGP на экспрессию генов нейротрофинов подтверждено рядом исследований [149], [150]. В любом случае на отметке 72ч под влиянием препаратов очевидно смещение количества транскриптов гена Cplx2 в сторону сближения с контрольной группой. Особенно это заметно в коре и сильнее выражено при действии PGP, нежели семакса.

Как уже говорилось выше, ишемия, семакс и PGP одинаково влияют на характер изменений экспрессии обоих изученных транскриптов гена Cplx2. В нашем эксперименте оба альтернативных варианта ведут себя одинаково, таким образом, ишемия не влияет на предпочтительный выбор экспрессии того или иного транскрипта. Опираясь на полученные результаты, можно сделать предположение, позволяющее объяснить схожее поведение альтернативных транскриптов при существующем у них различии в абсолютном количестве. Клетка продуцент синтезирует оба транскрипта, в определенном соотношении. Например, на две молекулы Cplx2_v1 всегда приходится приблизительно одна молекулы Cplx2_v2. При этом любые изменения в экспрессии Cplx2 одинаково затрагивают оба варианта, с сохранением соотношения. Так или иначе, одинаковый профиль экспрессии обоих транскриптов в рамках эксперимента указывает на их значительное функциональное сходство. В настоящее время неизвестно, какова функциональная значимость двух вариантов транскриптов гена Cplx2. Можно лишь предположить, что как в некоторых известных случаях, такой механизм регуляции экспрессии генов может быть использован, прежде всего, для временного и пространственного контроля над синтезом белка.

Эффекты семакса и PGP при схожей направленности количественно существенно отличаются. В целом влияние PGP на экспрессию гена Cplx2 выражено сильнее, чем влияние семакса. Однако поскольку семакс деградирует с образованием PGP (в том числе и его метаболитов), эффекты семакса могут быть обусловлены эффектами концевого трипептида PGP.

Выводы

1. Подготовлена панель образцов кДНК для анализа экспрессии генов в условиях экспериментальной ишемии головного мозга крыс и воздействия пептидов семакс и PGP.

2. Под воздействием ишемии относительное содержание транскриптов гена Cplx2 в коре головного мозга спустя сутки после окклюзии снижается в 2 раза. При этом влияния ишемии на содержание мРНК гена Cplx2 в подкорковых структурах не обнаружено.

3. В условиях фокальной ишемии оба исследуемых пептида вызывают снижение содержания мРНК гена Cplx2 в коре головного мозга крыс спустя 72 часа после окклюзии. Эффект PGP оказывается более выраженным, чем эффект семакса. Влияния препаратов в подкорке не наблюдается.

4. Не обнаружено различий в характере изменений экспрессии альтернативных транскриптов гена Cplx2 в условиях эксперимента.

Список литературы

1. Walsh G., Jefferis R. 2006. Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins // Nat Biotechnol 24: 1241—1252.

2. Jensen O.N. 2006. Interpreting the protein language using proteomics // Nat Rev Mol Cell Biol 7: 391—403.

3. Ernst J., Kellis M. 2010. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome // Nat Biotechnol. 28(8):817-25.

4. Zhou V.W., Goren A., Bernstein B.E. 2011. Charting histone modifications and the functional organization of mammalian genomes // Nat Rev Genet. 12(1):7-18.

5. Guelen L., Pagie L., Brasset E., Meuleman W., Faza M.B., Talhout W., Eussen B.H., de Klein A., Wessels L., de Laat W., van Steensel B. 2008. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions // Nature. 453(7197):948-51.

6. Ryba T., Hiratani I., Lu J., Itoh M., Kulik M., Zhang J., Schulz T.C., Robins A.J., Dalton S., Gilbert D.M. 2010. Evolutionarily conserved replication timing profiles predict long-range chromatin interactions and distinguish closely related cell types // Genome Res. 20(6):761-70.

7. Прошкина Г.М, Шпаковский Г.В. 2003. Структура и функции транскрипционного аппарата эукариотической РНК-полимеразы III //

Успехи биологической химии, т. 43, с. 139—162

8. Патрушев Л.И., Минкевич И.Г. Проблема размера геномов эукариот. – Успехи биологической химии, т. 47, 2007, с. 293–370.

9. http://humbio.ru/humbio/transcription/0003381d.htm

10. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. – М.: Наука, 2000. Глава 1, с. 25 – 58.

11. Guo H., Ingolia N.T., Weissman J.S., Bartel D.P. 2010. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels // Nature. 466(7308):835-40.

12. Khraiwesh B., Arif M.A., Seumel G.I., Ossowski S., Weigel D., Reski R., Frank W. 2010. Transcriptional control of gene expression by microRNAs // Cell. 140(1):111-22.

13. Bartel D.P. 2009. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions// Cell. 136(2):215-33.

14. Voinnet O. 2009. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs // Cell. 136(4):669-87.

15. Krol J., Loedige I., Filipowicz W. 2010. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay // Nat Rev Genet. (9):597-610.

16. Carthew R.W., Sontheimer E.J. 2009. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs// Cell.136(4):642-55.

17. Wu L., Belasco J.G. 2008. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs // Mol Cell. 29(1):1-7.

18. Eulalio A., Huntzinger E., Izaurralde E. 2008. Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing // Cell.132(1):9-14.

19. Filipowicz W., Bhattacharyya S.N., Sonenberg N. 2008. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? // Nat Rev Genet. (2):102-14.

20. Huntzinger E., Izaurralde E. 2011. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay // Nat Rev Genet. 12(2):99-110.

21. Martin K.C., Kosik K.S. 2002. Synaptic tagging- who's it? // Nat Rev Neurosci. (10):813-20.

22. Raj A., van Oudenaarden A. 2008. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences // Cell. 135(2):216-26.

23. Lehner B. 2010. Conflict between noise and plasticity in yeast // PLoS Genet. 6(11):e1001185.

24. Raser J.M., O'Shea E.K. 2005. Noise in gene expression: origins, consequences, and control // Science. 309(5743):2010-3.

25. Blake W.J., Balázsi G., Kohanski M.A., Isaacs F.J., Murphy K.F., Kuang Y., Cantor C.R., Walt D.R., Collins J.J. 2006. Phenotypic consequences of promoter-mediated transcriptional noise// Mol Cell. 24(6):853-65.

26. Huh D., Paulsson J. 2011. Non-genetic heterogeneity from stochastic partitioning at cell division // Nat Genet. 43(2):95-100.

27. Maier T., Güell M., Serrano L. 2009. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples // FEBS Lett. 583(24):3966-73.

28. de Sousa Abreu R., Penalva L.O., Marcotte E.M., Vogel C. 2009. Global signatures of protein and mRNA expression levels // Mol Biosyst.(12):1512-26.

29. Schwanhäusser B., Busse D., Li N., Dittmar G., Schuchhardt J., Wolf J., Chen W., Selbach M. 2011. Global quantification of mammalian gene expression control // Nature. 473(7347):337-42.

30. Greenbaum D., Colangelo C., Williams K., Gerstein M. 2003. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale // Genome Biol. 4(9):117.

31. Jacewicz M., Kiessling ., Pulsinelli W.A. J Cereb Blood Flow Metab 1986; 6: 263 – 272.

32. Гусев Е.И., Скворцова В.И., «Ишемия головного мозга», Москва, «Медицина» 2001, Глава 1: стр. 18 – 23.

33. Fisher M., Takano K. In: Ballierie’s clinical neurology, cerebrovascular disease (Hachinski V. ed.), London 1995; 279 – 296.

34. Astrup J., Siesji B.K., Symon L. Stroke 1981; 12: 723 – 725.

35. Symon L., Bronston N.M., Strong A.J. et al. J Clin Pathol 1977; 30: 149 – 154.

36. Ginsberg M.D., Pulsinelli W.A. Ann Neurol 1994; 36: 553 – 554.

37. Heiss W.D., Rosner G. Ann Neurol 1983; 14; 294 – 301.

38. Kirino T., Sano K. Acta Neuropathol 1984; 62: 209 – 218.

39. Kirino T., Tamura A., Sano K. Acta Neuropathol 1984; 64: 139 – 147.

40. Pulsinelli W.A., Brierley J., Plum F. Ann Neurol 1982; 491 – 498.

41. Butcher S.P., Bullock R., Graham D.I. et al. Stroke 1990; 21: 1727 – 1733.

42. Heiss W.D., Graf R. Curr Opin Neurobiol 1994; 1: 11 – 19.

43. Ozyurt E. J Cereb Blood Flow Metab 1988; 8: 138 – 143.

44. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view // Trends Neurosci. — 1999. — № 22. — С. 391-397.

45. Квитницкий-Рыжов Ю.Н. Современное учение об отёке и набухании головного мозга. — К.:: Здоров’я, 1988.

46. Мчедлишвили Г.И. Отёк головного мозга. — Тбилиси: «Мецниереба», 1986.

47. Черний В.И., Кардаш А.М., Городник Г.А., Дроботько В.Г. Диагностика и лечение отёка и набухания головного мозга. — К.:: Здоров’я, 1997. — С. 228.

48. Kuroda S., Siesjö B.K. Reperfusion damage following focal ischemia: pathophysiology and therapeutic windows  // Clin Neurosci. — 1997. — № 4. — С. 199-212.

49. Planas A.M., Gorina R., Chamorro A. Signalling pathways mediating inflammatory responses in brain ischaemia  // Biochem Soc Trans. — 2006. — № 34. — С. 1267-1270.

50. Евзельман М.А. Ишемический инсульт. Орёл, 2003.

51. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. 2001.

52. Garcia J.H., Yoshida Y., Chen H. et al. Am J Pathol 1993; 142: 623 – 635.