2.2.5. Анализ уровня экспрессии генов методом от-пцр

Сравнение уровня мРНК исследуемого гена и референсных генов в коре и подкорковых структурах крыс в условиях экспериментальной ишемии проводили с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени [143], [144], [145]. Определение относительного уровня мРНК исследуемого гена проводилось с помощью программы REST (Relative Expression Software Tool) [146], позволяющей сравнивать относительный уровень экспрессии гена в контрольной и опытной группах с учётом нормализации к контрольному гену и поправкой на эффективность ПЦР. В качестве контрольных генов использовали ген Gapdh (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, один из ферментов гликолиза), ген Rpl3 (этот ген кодирует белок L3, который входит в состав 60S субъединицы рибосомы.) и Ldha (ген кодирующий лактатдегидрогеназу). По отношению к мРНК этих генов нормировалось содержание исследуемых транскриптов. Гены Gapdh, Rpl3 и Ldha, будучи генами «домашнего хозяйства», характеризуются достаточно постоянным уровнем экспрессии в тканях мозга в том числе и в условиях экспериментальной ишемии, поэтому они могут быть использованы в количественных исследованиях мРНК в нервной ткани как референсные гены. В то же время использование нескольких референсных генов в количественном анализе ОТ-ПЦР позволяет проводить более точный анализ содержания транскриптов.

Математическая модель программы REST вычисляет относительный уровень экспрессии (R) исследуемого гена. Особенности работы модели состоят в следующем: рост сигнала флуоресценции связан с увеличением количества циклов ПЦР и прямо пропорционален накоплению продуктов амплификации:

C_n = C₀ (E)ⁿ = k r_n =k r₀(E)ⁿ ,

где C_n – концентрация после цикла n, С₀ – исходная концентрация кДНК, Е – эффективность амплификации, r₀ и r_n – соответствующие измерения флуоресценции, k – постоянная величина.

Прибор регистрирует номер цикла Сt, при котором уровень флуоресценции значительно отличается от фонового. Эта величина измеряется для всех образцов. Уровень экспрессии (R) гена вычисляется по следующей формуле:

R = C_{0 sample}/ C_{0 cont} = E^{(Ct cont – Ct sample)}

Уровень экспрессии исследуемого гена относительно контрольного:

R_rel.= R_target / R_{reference ,}

где R_target – уровень экспрессии исследуемого гена,

R_reference – уровень экспрессии референсного гена.

Итоговое выражение для вычисления относительного уровня экспрессии опытного гена (R_rel) имеет вид:

R_rel. = E_target^{(Ct cont –Ct sample)}/E_ref^{(Ct cont –Ct sample) ,}

где E_target – эффективность ПЦР для исследуемого гена,

E_ref – эффективность ПЦР для контрольного гена,

Ct _cont – уровень экспрессии гена контрольной группы,

Ct _sample – уровень экспрессии того же гена опытной группы.

Эффективность ПЦР определяется методом серии разведений одного из образцов и вычисляется по формуле для каждого гена и каждой структуры мозга:

E = 10^(-1/slope)

где slope – это наклон калибровочной прямой, отображающей зависимость Ct от концентрации кДНК.

Стандартная ошибка для значения эффективности рассчитывается следующим образом:

SE(E)= [(Е ln10) / slope²] s.e.(slope)

где SE(E) – стандартная ошибка (standard error) значения эффективности,

SE(slope) – стандартная ошибка наклона прямой.

Матрицей для ПЦР служила одноцепочечная кДНК, полученная с помощью обратной транскрипции мРНК, выделенных из тканей головного мозга крыс. Амплификация продуктов гена-мишени и гена-референса проводилась в разных пробирках при оптимальных условиях для каждого гена.

Для определения эффективности амплификации кДНК в тканях головного мозга крыс в присутствии каждой пары праймеров исследуемых генов проводили ПЦР серии разведений кДНК образцов для каждой исследуемой ткани. Используя данные пороговой флуоресценции Сt для разных количеств кДНК, рассчитывали эффективность амплификации для каждой пары праймеров, значения которой затем использовали для определения относительного уровня экспрессии исследуемых генов.

Статистическую обработку полученных данных экспрессии мРНК контрольного и исследуемых генов проводили в программе REST, позволяющей определять достоверность различий между группами с помощью статистического теста «Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test».

Нулевой гипотезой данного теста является предположение, что различия в относительных уровнях мРНК между опытными и контрольными группами отсутствуют. Данный тест неоднократно и случайно перераспределяет наблюдаемые значения Сt для опытных и контрольных животных и каждый раз отмечает влияние эффекта перестановки на разницу среднего значения Сt между опытными и референсными группами. Доля таких эффектов, где разница больше, чем реально наблюдаемая в эксперименте, относительно всех распределений дает значение «критерия рандомизации» – р. Статистически значимыми считаются различия со значением р ≤ 0,05.