2.2.2. Синтез одноцепочечной кДнк

Препараты суммарной РНК использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием реактивов RevertAid First Strand cDNA Sinthesis (MBI Fermentas, Латвия) в реакционной смеси объёмом 20 мкл. Спиртовую смесь, содержащую 5 мкг РНК, в течение 15 минут центрифугировали при 10000 оборотов в минуту, затем промывали 75% этанолом (100 мкл) и центрифугировали 5 минут в том же режиме. Остаток высушивали в концентраторе и растворяли в 12 мкл деионизированной воды, добавляли 1 мкл праймера олиго(dT)₁₈ и в течение 5 минут инкубировали при 70^оС, а затем помещали в лёд. Далее добавляли 4 мкл 5х буфера для обратной транскрипции, 1 мкл (20 ед.) ингибитора РНКаз, 2 мкл 10мМ смеси трифосфатов и выдерживали 5 минут при 37^оС. Затем в пробу добавляли 200 единиц ревертазы и инкубировали в течение часа при 42^оС. Реакцию останавливали 10-минутной инкубацией при 70^оС. Пробы одноцепочечной кДНК хранили при -20^оС.

2.2.3. Подбор праймеров

Специфичные праймеры к референсным генам Gapdh, Lhda, Rpl3 и двум транскриптам были подобраны с помощью пакета программ OLIGO Primer Analysis Software 6.31 и синтезированы фирмой ЗАО «Евроген».

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в ПЦР.

Праймер	Последовательность праймера	GeneBank acc. no.	Позиция нуклеотидов	Длина ПЦР-продукта
Gapdh (F)	5’-TGCCATCAACGACCCCTTCA-3’	NM_017008	117 - 136	188 п.н.
Gapdh (R)	5’-ACTCAGCACCAGCATCACCC-3’		285 – 304
Rpl3 (F)	5’-ATGGGTCCTTGGGCTTCTTG-3’	NM_1987532	58 - 77	239 п.н.
Rpl3 (R)	5’-CACAATACCCACAACCACCA-3’		277 - 296
Ldha (F)	5’-GCGTCTCCCTGAAGTCTCTGA-3’	NM_017025	726 - 746	232 п.н.
Ldha (R)	5’-TCCTTGATTCCATAGAGACCCT-3’		936 - 957
Cplx2_v1 (F)	5’-GGAGGAGTGAGGAGGACGGG-3’	U35099	24 - 43	132 п.н.
Cplx2_v1 (R)	5’-CACCAAGCAGGGTAGATAGCAT-3’		134 - 155
Cplx2_v2 (F)	5’-CTGGCTGAGGGGCGTGATT-3’	NM_053878	25 - 43	172 п.н.
Cplx2_v2 (R)	5’-CAGCAACCGTCTAAGCCACTG-3’		176 - 196

2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time pcr)

Реакционная смесь для ПЦР объёмом 25 мкл содержала 0,02 мкл пробы реакции обратной транскрипции, по 5 пкмоль прямого и обратного праймеров, 5x реакционной смеси («Евроген»), включающей буфер, Taq ДНК-полимеразу, набор дНТФ и интеркалирующий краситель SYBR Green I. Амплификация кДНК в присутствии праймеров к генам Cplx2 и ряда генов домашнего хозяйства (housekeeping genes), используемых в качестве референсных - Rpl3 (ген одного из рибосомальных белков), Gapdh (ген глицеральдегидфосфатдегидрогеназы), Ldha (ген лактатдегидрогеназы) - проводилась на приборе Step One Plus (Applied Biosystems).

Каждый образец кДНК анализировался трижды. На графиках зависимости уровня флуоресценции от температуры плавления продуктов амплификации для каждой пары праймеров обнаружен один максимум, соответствующий температуре плавления продукта ПЦР.

Амплификация проводилась в следующем режиме: нагревание до 95^оС (10 минут), далее шло 40 циклов следующего состава: денатурация при 95^оС - 10 секунд, отжиг праймера при 65^оС в течение 15 секунд, элонгация цепи при 72^оС - 20 секунд.

Работы по подготовке ПЦР (приготовление растворов, дозирование кДНК и реакционных смесей) проводились в ламинарном боксе. Носики для автоматических пипеток, вода и пипетки предварительно выдерживались под УФ-излучением в течение 15 минут.