Глава 2. Материалы и методы исследования

2. 1. Объект исследования

Исследования выполнены на крысах-самцах линии Wistar 2-х месячного возраста, массой 250 – 350 г, содержащихся в виварии при естественном освещении и имеющих свободный доступ к пище и воде. Все крысы (n=60) были разделены на 4 группы: 1-я – ложнооперированные животные, которым вводили физиологический раствор, 2-я – животные после окклюзии левой средней мозговой артерии, которым вводили физиологический раствор (n=15); 3-я – животные, которых подвергали окклюзии левой средней мозговой артерии и вводили препарат семакс (n=15); 4-я – животные, которых подвергали окклюзии левой средней мозговой артерии и вводили препарат PGP (n=15); Экспериментальные группы были разделены на 3 подгруппы в зависимости от временной точки (3, 24 и 72 часа) и состояли не менее чем из четырех животных.

Дистальная окклюзия средней мозговой артерии у крыс

Рисунок 2.1. Схема эксперимента

Использованная нами экспериментальная модель фокальной ишемии мозга крыс была отработана и выполнена в совместной работе с сотрудником кафедры фармакологии Факультета Фундаментальной Медицины МГУ О. В. Поваровой [141].

Фокальную ишемию мозга у экспериментальных животных вызывали с помощью коагуляционной окклюзии дистального участка (выше места ответвления a. lenticulostriatis) левой средней мозговой артерии. Операцию проводили под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг, внутрибрюшинно). Для каждой временной точки (3, 24 и 72 часа) в качестве положительного контроля использовали группу ложнооперированных крыс. Таких животных под наркозом подвергали аналогичной процедуре подготовки операционного поля с левой стороны, но не производили коагуляцию артерии. Через 15 мин, 1 час, 4 часа и далее через каждые 4 часа крысам внутрибрюшинно вводили один из препаратов: семакс, PGP или физиологический раствор. Семакс использовали из расчета 10 мкг/100 г веса крысы; PGP – 3.75 мкг/100 г. Через 3, 24 и 72 часа крыс декапитировали под действием эфирного наркоза.

Из мозга крыс выделяли лобно-теменную долю коры и соответствующие ей подкорковые структуры (Рис. 5). Ткани замораживали в жидком азоте, а затем хранили при –70С.

Коронарный срез мозга крысы через 3 часа после окклюзии левой средней мозговой артерии на уровне брегмы

2.2. Методы исследования

2.2.1. Электрофоретическое разделение рнк

Материалы: для приготовления 1,5% агарозного геля требуется 1,5 г агарозы на 100 мл 1х ТАЕ (трис-ацетатного буфера).

Для приготовления 100 мл трис-ацетатного буфера (50х ТАЕ): 24,22 г триса (трис(гидроксиметил)аминометана (HOCH₂)₃CNH₂ ), 1,862 г ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 8,96 мл ледяной уксусной кислоты и 73,3 г деионизированной воды.

Для приготовления денатурирующего буфера для нанесения РНК: 50% деионизированный формамид, 6% формальдегид, 1х ТАЕ, 0,03% краситель бромфеноловый синий.

Важным условием для получения адекватных данных при оценке количества мРНК в биологических образцах является качество полученных из них препаратов суммарной РНК [142].

Для подтверждения нативности полученных нами препаратов суммарной РНК проводили их электрофоретическое фракционирование в агарозном геле в денатурирующих условиях (Рис. 6). Осадок РНК (1 – 2.5 мкг) растворяли в денатурирующем буфере для нанесения РНК. Фракционирование РНК проводили в горизонтальном 1.5% агарозном геле. Для приготовления геля необходимое количество агарозы растворяли с нагреванием в 1х ТАЕ. Образцы перед нанесением на гель прогревали при 65С в течение 15 минут в термостате «Гном» (ДНК-технология, Россия), охлаждали во льду 5 минут и наносили на гель.

Рисунок 2.2. Электрофореграмма суммарной РНК лобно-теменной доли коры крыс в денатурирующем 1,5% агарозном геле. 28S, 18S, 5S – субъединицы рибосомной РНК. 1, 2, 3 – препараты РНК коры мозга крыс.

Электрофорез проводили в течение 30 минут в камере для горизонтального электрофореза (BioRad, США) при напряжении 120В, источник питания «Эльф-8» (ДНК-технология).