Cодержание

Введение……………………………………………………………………………………………………………………………………2

Глава 1. Обзор литературы……………………………………………………………………………………………………………...4

1.1.1. Регуляция экспрессии генов…………………………………………………………………......................................................................4

1.1.1.1. Экспрессия генов и её особенности……………………………………………………………………………………………………...4

1.1.1.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции…………………………………………............................................................6

1.1.1.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов…………………………………………………………………………………..7

1.1.2. Проблемы изучения транскриптома………………………………………………………….....................................................................8

1.2. Церебральная ишемия………………………………………………………………………………………………………………………..11

1.2.1. Реакция тканей на снижение уровня кровотока………………………………………………………………………………………….11

1.2.2. Клеточные реакции при ишемии головного мозга……………………………………………………………………………………….13

1.2.3. Глутамат-кальциевый каскад………………………………………………………………………............................................................17

1.2.4. Реакция генома на ишемию……………………………………………………………………………………………………………......19

1.2.5. Комплексины и их возможное участие в глутаматной эксайтотоксичности…………………………………………………………..21

1.3. Нейропротекция при ишемии……………………………………………………………………………………………………………….24

1.3.1. Семакс и PGP………………………………………………………………………………………………………………………………25

Глава 2. Материалы и методы исследования………………………………………………………………………………………..28

2.1. Объект исследования………………………………………………………………………………………………………………………...28

2.2. Методы исследования………………………………………………………………………………..............................................................31

2.2.1. Электрофоретическое разделение РНК…………………………………………………………………………………………………...31

2.2.2. Синтез одноцепочечной кДНК…………………………………………………………………….............................................................32

2.2.3. Подбор праймеров………………………………………………………………………………………......................................................33

2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time PCR)……………………………………………………………………34

2.2.5. Анализ уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР………………………………………………………………………………………35

Глава 3. Результаты……………………………………………………………………………………………………………………….39

3.1. Влияние ишемии на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс…………………………………38

3.2. Влияние семакса на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс…………………………………41

3.3. Влияние PGP на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс……………………………………..43

Глава 4. Обсуждение результатов………………………………………………………………………………………………………..46

Выводы……………………………………………………………………………………………………………………………………….52

Список литературы…………………………………………………………………………………………………………………………53

Введение

Одной из задач медицины и физиологии является исследование возможности целенаправленного влияния на физиологические и биохимические процессы в клетках и тканях при возникновении патологий. Для этого необходимо понимать особенности функционирования генетического аппарата в разных условиях и при разных воздействиях. Ишемический инсульт является повреждающим фактором, заметно нарушающим функционирование мозга и существенно влияющим на экспрессию генов в головном мозге. Нарушения при ишемическом инсульте провоцируются резким ухудшением мозгового кровотока, влекущим за собой кислородную и глюкозную недостаточность, нарушение протекания окислительно-восстановительных процессов в клетке, падение уровня АТФ, нарушение функционирования ионных каналов, изменение внутриклеточной среды, в конечном итоге – гибель нейронов. Почти в половине зарегистрированных случаев ишемический инсульт заканчивается летальным исходом, а из выживших пациентов большинство остаётся инвалидами. Поэтому поиск новых подходов для лечения ишемического инсульта является актуальной научной и медицинской проблемой.

Ключевым механизмом ишемического повреждения является процесс глутамат-кальциевого каскада, когда под влиянием гипоксии усиливаются процессы анаэробного гликолиза, внутриклеточная среда закисляется и нарушается активный ионный транспорт, что приводит к массивному высвобождению возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата, в том числе в составе синаптических везикул.

К числу цитозольных белков, специфичных для нервной ткани и регулирующих процесс экзоцитоза, относятся комплексины. Анализ экспрессии генов комплексинов может помочь уточнить их роль в развёртывании глутаматной эксайтотоксичности.

В настоящее время для лечения ишемического инсульта широко используется нейропротекторный препарат семакс, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН. Семакс – синтетический гептапептид (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин). N-конец данного гептапептида содержит фрагмент адренокортикотропного гормона (АКТГ 4-7), а С-конец – трипептид пролил-глицил-пролин (PGP), который препятствует взаимодействию молекулы семакса с эндогенными эндопептидазами. Имеются научные данные о том, что PGP обладает также самостоятельным регуляторным действием. Исследование свойств семакса при церебральной ишемии у крыс, а также исследование эффектов препарата на клеточных культурах in vitro показывают, что применение семакса уменьшает степень выраженности патологии. Однако до конца молекулярный механизм действия этого нейропептида не ясен. Изучение экспрессии генов в условиях экспериментальной ишемии мозга и введения препарата семакс позволяет не только уточнить детали патологического процесса, но и оценить эффективность терапевтических процедур. Целью данной работы является анализ изменения экспрессии гена комплексина-2 (Cplx2), вызванных ишемией головного мозга, а также введением регуляторных пептидов семакс и PGP. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать качество препаратов тотальной РНК, выделенных из мозга экспериментальных животных, ситезировать на их основе препараты кДНК.

2. При помощи метода ОТ-ПЦР оценить изменение относительного содержания альтернативных транскриптов гена Cplx2 в лобных долях коры и в подкорковых структурах головного мозга крыс в результате действия фокальной ишемии, а также введения препаратов семакс и PGP