12. Феномен преципітації

Реакція преципітації (РП). Реакція антиген-антитіло представлена ​​преципітацією. Заснована на осадженні антигену з розчину специфічними антитілами. Комплекс антиген - антитіло випадає в осад тільки за певних співвідношеннях концентрацій реагуючих молекул. Область цих співвідношень, при яких в надосадової рідини після утворень преципитата не виявляються ні вільні антигени, ні вільні антитіла, називається зоною еквівалентності. Поза цієї зони, при надлишку антитіл або антигену, феномен преципітації не відбувається, так як утворюється розчинна комплекс антиген - антитіло. Реакція преципітації менш чутлива, ніж реакція аглютинації.Існують модифікації реакції преципітації. Найпростіший спосіб постановки - кільцепреципітації, яку виконують в пробірках шляхом нашарування на імунну сироватку різних розведень прозорого розчину антигену. На кордоні двох реагуючих систем через певний час з'являється опалесціюючий сіро-біле кільце преципітації. Саме таким чином при вивченні стерильних фільтратів бульйонних культур збудників холери, черевного тифу, чуми, сибірської виразки і відповідних антисироваток в кінці XIX століття (1897) були виявлені преціпітіни.Реакція преципітації може бути поставлена ​​в агарових гелі (іммунодіффузія по Ухтерлоні). Принцип цього методу полягає в наступному. Розчинні антигени і антитіла вносять у лунки, вирізані в гелі на певній відстані. Компоненти реакції дифундують в шарі агару назустріч один одному, утворюючи в зоні контакту преципітат у вигляді каламутній видимої лінії преципітації.Для більш детальних імунологічних досліджень застосовують метод іммуноелектрофореза, запропонований П. Грабар і К. А. Вільямсом (1953). Спочатку здійснюють електрофоретичної поділ антигену, що представляє собою часто суміш білкових або інших молекул в забуференном агарових гелі. Після поділу в канавку, яка йде в напрямку міграції антигенних речовин, вносять преципітуючих сироватку. Антиген і антисироватки дифундують в гелі назустріч один одному, і в місці їх взаємодії виникають дугоподібні лінії преципітації. За кількістю, положенню і формі цих ліній дають висновок про склад вихідної суміші антигенів.

Преципітація - це серологічна реакція, яка полягає у взаємодії розчинної антигену з антитілом з подальшим випаданням дрібнозернистого осаду (преципітату). Реакція преципітації дозволяє визначити в досліджуваному матеріалі присутність невідомого антигену шляхом додавання відомого антитіла або за допомогою відомого антигену - невідоме антитіло. Преципітація йде гірше за відсутності солей. Оптимум преципітації знаходиться в діапазоні рН = 7,0-7,4. Механізм преципітації близький до механізму аглютинації. Під впливом імунної сироватки, прореагованою з антигеном, зменшується ступінь його дисперсності. Необхідно, щоб сироватка та антиген були абсолютно прозорі. При постановці преципітації можна до одного розведенню сироватки додавати різні розведення антигену або навпаки. Преципитация реєструється краще, якщо антиген нашаровувати в пробірці на антитіло. При цьому спостерігається поява преципітату у вигляді кільця - кільцепреципітації. Кільце преципітації проводять у спеціальних пробірках діаметром 2,5-3,5 мм. Для визначення числа антигенів у досліджуваному матеріалі або різних антитіл в сироватці користуються реакцією преципітації в агарі: 1% освітлений агар розливають в чашки Петрі або на предметні скла. У різні лунки, зроблені в агарі, наливають розчини антигену і антитіла, які дифундують назустріч один одному, утворюючи лінії преципітації. Реакція преципітації широко використовується при діагностиці сибірки (див. Асколі реакція). Преципитация в агарі дозволяє визначати токсигенність дифтерійних культур. У судово-медичних дослідженнях преципитация служить для встановлення видової приналежності крові, органів і тканин за допомогою специфічних преципитирующих сироваток.

Преципитация - реакція осадження комплексу антигену (преципітиногену) і антитіла (преціпітіни). Преципитация - один з імунологічних феноменів, що дозволяють визначити вміст антитіл (див.) в сироватці крові хворих або вакцинованих людей, а також у крові імунізованих тварин. При використанні стандартних сироваток реакція преципітації може бути застосована для титрування різних за походженням розчинних антигенів (див.). При найбільш простій формі постановки реакції преципітації до ряду пробірок з постійною кількістю антигену додають подслаіваніем досліджувану сироватку в серії кратних розведень. Після 30-60 хв. інкубації при кімнатній температурі на межі двох рідин утворюється кільце помутніння - кільцепреципітації. Мінімальна кількість сироватки, яке дає реакцію П., приймають за титр антисироватки. При зворотній постановці реакції зі стандартною антисироваткою вдається оцінити відносну концентрацію антигену в різних біологічних рідинах. Результати титрування антитіл і антигенів на підставі вищевказаного методу не мають абсолютного кількісного вираження. З метою кількісної оцінки вмісту антитіл Гельдербергер, Кабат (М. Heidelberger, Є. Kabat) та ін розробили кількісний метод реакції преципітації, в основі якого лежить виявлення так звані зони еквівалентності. При змішуванні вікових кількостей антигену з постійними обсягами антисироватки кількість утворюється преципитата спочатку зростає, а потім знову знижується через збільшення розчинності комплексу антиген - антитіло в надлишку антигену. Якщо визначити у всіх пробірках вміст антитіл в надосадової рідини, то виявиться, що в середніх пробірках ряду або навіть в єдиній пробірці антитіл у надосадової рідини немає; разом з тим тут же утворюється найбільший за величиною преципітат. Оскільки в зоні еквівалентності в преципітат втягується також весь антиген, введений в суміш реагуючих речовин, після вирахування з кількості білка преципитата білка антигену отримують точну величину вмісту антитіл у даному обсязі випробуваної сироватки. Вміст білка преципитата після ретельного промивання охолодженим физиол. розчином визначають по азоту або яким-небудь колориметричним методом. При оцінці значення реакції преципітації як діагностичного методу необхідно враховувати, що в імунних сироватках можуть бути присутніми антитіла, не володіють властивостями преципітинів і, отже, не утворюють преципітату при взаємодії з антигеном. До їх числа відносяться насамперед неповні антитіла, а також деякі інші антитіла, які відносяться до групи гамма-А-глобулінів. Здатність антисироватки преципітувати антиген може бути порушена нагріванням до 65-70 °, обробкою органічними розчинниками, відновленням у кислому середовищі [Ізлікер (Н. Isliker), А.Я. Кульберг]. Феномен преципітації з антисироваткою, завідомо містить преціпітіни, можливий лише при певній температурі, концентрації солей і водневих іонів. Найшвидше реакція П. протікає при 25-37 °. Неодмінна умова освіти преципитата - присутність в ізотонічних концентраціях хлориду натрію (0,85% розчину NaCl). При збільшенні концентрації NaCl до 15% преципітати, утворені антигеном полисахаридной природи, частково розчиняються, чим можна скористатися для вилучення чистих антитіл. Реакція преципітації з антигенами білкової природи протікає з однаковою швидкістю і повнотою як у 0,85%, так і в 15% розчинах NaCl. Оптимальна для утворення преципітату концентрація водневих іонів відповідає значенням рН від 5,0 до 9,0. У лабораторній практиці знаходять застосування різні модифікації реакції преципітації. Зокрема, реакцію термопреципітації застосовують для виявлення антигенів бактерій сибірської виразки, ботулізму та ін, що не піддаються термічній денатурації (коктоантігени). Ця реакція відрізняється від реакції кільцепреципітації тільки тим, що в якості антигену використовують фільтрат прокипяченного досліджуваного матеріалу (см. А сколи реакція).