Б) определение титра лизоцима микрометодом по н.С. Мотавкиной, б.М. Ковалеву, а.С. Шаронову (1979)
В камеру, состоящую из 2 фотопластин и ограничивающей прокладки между ними, внести смесь расплавленной и остуженной до +45С° 2% агарозы и культуры микрококка в концентрации 500 тыс. мт/мл. После застывания агарового субстрата, верхнюю пластинку снимают скользящим движением и с помощью пробойника делают лунки, вносят в одну из них испытуемое вещество, в другую - раствор кристаллического лизоцима. Последний служит контролем и вносится в разных концентрациях в равных объемах. Инкубировать 3 часа при +37С° во влажной камере.
По лизису тест-микроба в присутствии кристаллического лизоцима в контроле строится график зависимости диаметра зоны лизиса от концентрации этого вещества. Диаметр лизиса опытных проб сопоставляют с показателями графика и определяют в них активность (титр) лизоцима.
Приложение 3
Определение титра комплемента по 100% гемолизу гемосистемы
Приготовить гемосистему:
а) приготовить 3% взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе;
б) гемолитическую сыворотку развести до рабочего титра, указанного на этикетке;
в) приготовить гемолитическую систему, смешав равные объемы 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки;
г) инкубировать при +37С° 30 минут;
д) определение титра комплемента осуществить по схеме:
Ингредиенты
|
Номера пробирок и их содержимого |
||||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
К |
||
Сыворотка крови больного 1:10 в мл
|
0,1
|
0,15
|
0,2
|
0,25
|
0,3
|
0,35
|
0,4
|
0,45
|
0,5
|
-
|
|
Физиологический раствор 0,85% в мл
|
0,4
|
0,35
|
0,3
|
0,25
|
0,2
|
0,15
|
0,1
|
0,05
|
-
|
0,5
|
|
Гемолитическая система в мл |
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
|
Инкубировать при +37 С° 30-40 минут |
|||||||||||
Учет результатов |
Отсутствие гемолиза |
Гемолиз |
Нет гемолиза |
||||||||
Титр комплемента - 0,3 мл (минимальное количество, дающее гемолиз гемосистемы).
Это количество можно представить в гемолитических единицах.
Пример: Расчет в гемолитических единицах
0,2 мл - 1 гем.ед.
1,0 мл – х
С учетом разведения сыворотки 1: 10 титр комплемента в гемолитических единицах будет равен: 5 х 10 = 50 гем. ед.