Уметь объяснить принцип метода определения и клинико-диагностическое значение некоторых биохимических показателей 1. Разделение и количественное определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге.

Принцип метода. Электрофорез – это движение заряженных частиц в поле постоянного электрического тока. Скорость перемещения молекул белков в электрическом поле зависит от величин заряда, молекулярной массы, pH, ионной силы раствора.

Белки сыворотки крови помещают на полоску бумаги, смоченную буферным раствором, через которую пропускают постоянный электрический ток. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжаются отрицательно и под воздействием электрического поля перемещаются к аноду.

Сыворотка крови человека содержит различные белки. С помощью электрофореза на бумаге выделяются 5 фракций - альбумины, α₁-, α₂-, β-, γ-глобулины.

Клинико-диагностическое значение. Многие патологические состояния сопровождаются количественными изменениями соотношения белковых фракций крови – диспротеинемиями. Уменьшение содержания фракции альбуминов характерно для заболеваний печени за счет снижения белок-синтезирующей функции гепатоцитов. Гипоальбуминемия также сопровождает заболевания почек вследствие потери белка с мочой. Увеличение содержания фракций α₁- и α₂-глобулинов наблюдается при стрессе, наличии воспалительных процессов за счет белков «острой фазы», при коллагенозах и метастазировании злокачественных новообразований. Фракция β-глобулинов растет при гиперлипопротеинемиях. Фракция γ-глобулинов повышается при иммунных реакциях, вызванных вирусными и бактериальными инфекциями. Снижение γ-глобулиновой фракции может иметь место при первичном и вторичном иммунодефиците.

Содержание белковых фракций сыворотки крови, полученное с помощью электрофореза на бумаге, в среднем составляет у взрослого человека:

альбумины 55,4-65,9 %

α₁-глобулины 3,4-4,7 %

α₂-глобулины 5,5-9,5 %

β-гдобулины 8,9-12,6 %

γ-глобулины 13-22,2 %

Количественное определение белка сыворотки крови биуретовым методом.

Клинико-диагностическое значение. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическому свойству. Нормальное содержание белка в сыворотке крови 65-80 г/л, у детей до 6 месяцев 48-56 г/л.

Изменение содержания белка в сыворотке крови может свидетельствовать о различных нарушениях. Снижение содержания белка (гипопротеинемия) может наблюдаться при потерях белка (кровотечения, болезни почек), при белковом голодании или при снижении процессов биосинтеза белка в результате различных заболеваний (интоксикации, злокачественных новообразований, хронических заболеваний). Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) бывает редко, это может быть при сгущении крови из-за значительной потери жидкости (длительная рвота, ожоговая болезнь, диарея), при наследственных заболеваниях - парапротеинемиях.

Одним из методов количественного определения суммарного белка сыворотки крови является биуретовый метод, который основан на способности белков, содержащих пептидные связи, образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.

2.1 Определение активности амилазы ротовой жидкости по Вольгемуту.

Амилаза - фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы (химизм реакции см. занятие№6). Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой слюнные и поджелудочная железы.

Клинико-диагностическое значение имеет определение активности амилазы в крови, куда она попадает из поджелудочной железы (40%) и слюнных желез (60%). Амилазная активность крови по Вольгемуту в норме составляет 25-125 Ед/л. При остром панкреатите в первые сутки заболевания активность амилазы крови возрастает в десятки раз, а затем постепенно возвращается к норме. Амилазная активность крови увеличивается также при паротите (воспалении слюнных желез). Амилаза имеет небольшую молекулярную массу – 45 000, поэтому легко проходит почечный фильтр и попадает в мочу. В связи с меньшей инвазивностью определение амилазной активности мочи (диастазный тест) широко используется в клинике для диагностики состояния поджелудочной железы (см. УИРС).

Принцип метода. Метод основан на том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и тоже количество раствора крахмала и находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала. Затем производят перерасчет активности фермента на 1 мл слюны.

Амилазная активность слюны или амилокластичекая сила слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в мл, которое может расщепляться 1 мл слюны при температуре 38⁰ в течении 30 мин.

В норме амилазная активность слюны составляет 160-320 ед.

2.2 Исследование амилазной активности мочи.

Исследование амилазной активности мочи по Вольгемуту производится аналогично методике приведенной выше для определения активности амилазы слюны). Амилазная активность мочи также отражает и величину клубочковой фильтрации. Снижение активности этого фермента в моче наблюдается при почечной недостаточности. В норме амилазная активность мочи по Вольгемуту составляет от 16 до 64 Е.

Для определения активности амилазы можно использовать также модификацию Бюхнера. По данному методу амилазная активность мочи выражается количеством фермента, расщепляющим 2 мг крахмала за 15 мин.

3. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче. Принцип метода. Пировиноградная кислота является одним из промежуточных продуктов углеводного обмена. Пировиноградная кислота взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде, образуя 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты желто-оранжевого цвета, интенсивность окрашивания которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты.

Гидразоны α-кетоглутаровой, щавелевоуксусной, дегидроаскорбиновой кислот в щелочной среде нестойки и быстро разлагаются.

Увеличение выделения ПВК с мочой наблюдается при авитаминозе и гиповитаминозе В₁. Содержание ПВК в крови и экскреция с мочой возрастает также при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы. При наркозе содержание ПВК в крови, напротив, снижается.