Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут. 

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одно цепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

Иммуноферментный анализ

(ИФА)

            Серологическая диагностика (определение специфических антител) позволяет в ряде случаев определить стадию и характер течения заболевания. Методы непрямого выявления бактерий особенно хороши при трудностях взятия материала для обнаружения антигена, например у детей. В основе метода лежит выявление специфических антител, которые накапливаются в сыворотке крови и секретах инфицированного организма, в процессе иммунного ответа на внедрение возбудителя инфекционного заболевания. Антитела относятся к трем классам иммуноглобулиновых молекул: M, G и A. Накопление антител каждого из этих классов происходит через разные промежутки времени от начала иммунного ответа и зависит от характера инфицирования (первичное или вторичное). При первичном инфицировании сначала появляются антитела класса М, затем – G, и в последнюю очередь – А. По мере угасания иммунного ответа снижение концентрации (титра) антител каждого из классов происходит в той же последовательности. Иммунный ответ при повторном проникновении возбудителя инфекционного заболевания характеризуется быстрым нарастанием титра антител классов G и А, и практически полным отсутствием антител класса М.             Таким образом, при остром инфекционном процессе у больных можно обнаружить антитела класса М или быстро нарастающие/снижающиеся количества антител классов G и А. Напротив, при хронически протекающих заболеваниях выявляются специфические антитела классов G и А, концентрации которых не изменяются на протяжении длительного времени. В ряде случаев (около 3%) при хронически протекающих заболеваниях, прежде чем образуются антитела класса G, в течение нескольких недель регистрируются невысокие титры антител класса А. У больных с бессимптомным течением инфекционного заболевания определение антител класса А в постоянно низких титрах, на протяжении многих недель, говорит о наличии микробной персистенции. Низкие, неменяющиеся во времени титры специфических антител класса G указывают на давно перенесенную хламидийную инфекцию. В процессе терапии двух- трехкратное снижение количества антител классов G и А указывает на ее успешное проведение.            Для того, чтобы оценить динамику изменений титров антител различных классов, в клинике часто используют метод парных образцов. В соответствии с этим методом у одного и того же пациента проводят качественный и количественный анализ специфических антител с интервалом 2-3 недели. На основании сравнения результатов при первом и втором обследовании делают заключение о характере и стадии инфекционных заболеваний. 

Преимущества ИФА-анализа:

• Высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,01 нг/мл.

• Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

• Возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

• Стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

• Простотой проведения реакции;

• Наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;

• Возможностью автоматизации всех этапов реакции;

• Экологической чистотой и безопасностью для мед, персонала (в отличии от РИА);

• Относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

Определение неизвестных АГ состоит из следующих этапов:

• Связывание АТ, специфичных для искомого АГ. С пластиком лунки планшета;

• Внесение антигенсодержащего материала;

• Внесение 2-х антител той же специфичности;

• Внесение конъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки);

• Внесение хромогенного субстрата;