III. Природные среды и субстары, отходы производства для культивирования биологических объектов
Источником природного сырья является сельское хозяйство и отрасли лесоводства. Получаемые в этих отраслях материалы представляют собой соединения различной химической сложности и включают сахара, крахмал, целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин.
Наиболее подходящим и доступным питательным субстратом для биотехнологических процессов является сырьё, используемое в производстве сахара – сахарный тростник и сахарная свёкла. Существенную значимость представляют крахмалосодержащие с/х продукты, включающие различные злаки, картофель и другие корнеплоды; содержащихся в них крахмал обладает одним недостатком – он является полисахаридом, поэтому должен быть переведен до моно-, либо олигосахаров, доступных для микроорганизмов. Целлюлоза составляет половину высушенной растительной массы как с/х, так и лесного производства и является ценнейшим источником энергии и углерода; она представляет собой наиболее распространённый и возобновляемый источник сырья, однако должны быть преодолены технологические трудности, прежде чем окажется выгодным использование целлюлозы; трудности связаны с процессом предобработки целлюлозы, который разрушается путём химического или ферментативного гидролиза до растворимых сахаров, которые, в свою очередь, легко подвергаются ферментации микроорганизмами с образованием этанола, бутанола, ацетона, одноклеточного белка, метана и других продуктов.
В биотехнологии большое внимание также уделяется и другим видам растительной массы – плодам с соком, клубням, травяной массе, которые являются источниками растительного природного сырья. На ровне с этим одной из главных задач биотехнологии является максимальное использование огромных объёмов органических отходов; их утилизация обеспечивает удаление источников загрязнения, а также обусловит превращение этих отходов в полезные целевые продукты. В качестве таких отходов в биотехнологии широко используются отходы с/х, деревообрабатывающей, бумажной и пищевой промышленности. В настоящее время на основе этих отходов (меласса/чёрная патока, молочная сыворотка и другие) осуществляется ферментационным процессом.
Технологии ферментационных процессов
I. УСТРОЙСТВО ФЕРМЕНТЕРОВ И БИОРЕАКТОРОВ И СИСТЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В НИХ
Ферментеры (ферментаторы/биореакторы) представляют собой камеры, в которых в жидкой или на твёрдой среде выращивают микроорганизмы.
Процесс, происходящий в ферментере – ферментация.
Различают 2 основных типа ферментеров: первый предназначен для культивирования микрообъектов в аэрируемых условиях, а второй – в бескислородных условиях.
Современные биореакторы – многофункциональные устройства, которые должны обладать следующими свойствами:
1. Эффективного перемешивания и гомогенизации питательной среды
2. Обеспечение свободной и быстрой диффузии газообразных компонентов аэрируемой среды
3. Теплообмен, обеспечивающий поддержание температуры внутри реактора
4. Пеногашение
5. Стерилизации
6. Контроль и регулировка процесса ферментации
Главное требование, предъявляемое к ферментерам – сохранение стерильности, поэтому они должны быть герметичными, а все линии трубопровода должны быть доступны для обработки горячим паром.
Рабочий объём ферментатора – не более 0,7 от общего объёма ферментов.
Конструкторские различия биореакторов определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды. Различают:
1. Ферментеры с подводом энергии к газовой фазе – ФГ; в них для аэрации и перемешивания питательной среды используется сжатый воздух, подаваемый с высокой скоростью и под определённым давлением; в этих аппаратах отсутствуют системы механического перемешивания; в них проще поддерживать асептические условия; недостатком является низкая скорость массообмена по сравнению с биореакторами, в которых используется механическое перемешивание; ферментеры типа ФГ используются для производства белка одноклеточных.
2. В производстве кормового белка широкое распространение получили ферментеры с мешалками, в которых подвод энергии осуществляется в жидкой фазе – ферментеры типа ФЖ; этот тип представляет собой вертикальный цилиндр, снабжённый циркуляционными, теплообменными и аэрирующими устройствами; теплообменные устройства выполнены в виде трубок, которые установлены в трубных решётках.
3. В аппаратах типа ФЖГ осуществляется комбинированный подбор энергии к газовой фазе для аэрации и к жидкой фазе для перемешивания; ферментер снабжается механической мешалкой и системой аэрации. Одним из положительных моментов является длительное (до нескольких суток) поддержание стерильности при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцентов; такие ферментеры применяются в производстве антибиотиков и витаминов.
Во время ферментации возникают некоторые трудности, которые преодолеваются с помощью определённых систем. Серьёзной проблемой является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования питательной среды, в которой присутствуют поверхностно-активные вещества, как продукты распада жиров, и белки (компоненты питательной среды). Образующийся слой пены с одной стороны способствует росту аэробных микроорганизмов, а с другой стороны сокращает полезный объём биореактора, тем самым способствует заражению продуцентов посторонней микрофлорой. Это заставляет разрабатывать системы пеногашения, как средств борьбы с избыточным пенообразованием. В настоящее время разработаны химические, механические, акустические типы пеногашения. Наиболее часто используются химические и механические.
К химическим относятся поверхностно-активные вещества, которые способны внедрятся в стенки пузырей, становясь их центрами неустойчивости (растительные масла, животные жиры). Недостатком химического пеногашения является то, что используемые химические вещества могут быть утилизированы микроорганизмами и тем самым по себе становятся источником пенообразования.
Механические пеногасители представляют собой устройства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны и другие, которые располагаются обычно в верхней части реактора. Используются также сепараторы пены, которые одновременно служат и для сбора биомассы микроорганизмов, содержащихся в пене.
Крайне важным моментом при работе биореакторы является обеспечение должного уровня теплообмена, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность продуцентов очень сильно зависит от колебания температур. Температурный оптимум зависит от вида микроорганизма, но чаще находится в пределах 30-50 градусов Цельсия. Теплообмен поддерживается с помощью рубашки биореактора. В качестве нагревающего или охлаждающего агента выступает вода.
Система аэрации зачастую бывает сложной конструкции, поскольку должна обеспечить доступ воздуха с определённым количество О2, поддержать баланс О2 и СО2 во время ферментации и отвод отработанных газов их реактора, при этом большое внимание уделяется обеззараживанию воздуха – для этого используют полипропиленовые мембраны, которые хорошо себя закоремендовали при промышленном получении интерферона.
Для эффективной работы биореактора необходимо осуществить перемешивание его содержимого с целью сохранения равномерной температуры во всём объёме, а также эффективному использованию компонентов питательной среды и отводу продуктов метаболизма. В качестве перемешивающих устройств используют механические мешалки, при этом они могут быть многоярусные и к внутренним стенкам биореактора прикрепляют отражающие перегородки, которые предотвращают возникновение водоворотов и обеспечивают вихревое движение жидкости. Однако в ряде продуцентов (мицелярные грибы) использование мешалок сопряжено с их обрастанием мицелием грибов. Поэтому предусматривают системы периодического перемешивания на разных скоростях.
II. СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
Большинство ферментационных технологий связано с жидкими аэрируемыми системами. Однако, в настоящее время достаточно широко используются ферментационные технологии, основанные на утилизации плотных субстратов при отсутствии либо малом количестве воды, а также в бескислородных условиях.
1. Аэробная ферментационная технология
Связана с проведением процесса ферментации в аэрируемых условиях.
2. Анаэробная ферментационная технология
Сопровождается проведением ферментации, во время которой в качестве подаваемых газов выступает водород, метан, но не кислород. Газофазные процессы осуществляются в аппаратах с твёрдым наполнителем. В таких аппаратах получают спирт на основе дрожжей, а также биомассу дрожжей.
3. Твёрдофазные ферментационные технологии
Осуществляются на основе растительного сырья и в качестве продуцентов используются мицелярные грибы, дрожжи или их комбинация. Различают 3 типа твёрдофазных процессов:
1) Поверхностное культивирование продуцентов на субстрате, слой которого не превышает 7 см – тонкий слой; в этом типе процессов в качестве биореакторов используются большие (до нескольких м2) подносы или культуральные камеры.
2) Глубинные процессы, идущие в не перемешиваемом слое – высокий слой, при этом биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды; для аэрирования разработаны приспособления, обеспечивающие конвекционный и диффузионный газообмен.
3) Перемешиваемые процессы – протекают в перемешиваемой аэрируемой массе субстрата, который может быть гомогенным полужидкой консистенция или состоять из частиц твёрдого вещества, взвешенных в жидкости; для этого обычно используют биореакторы с низкоскоростным перемешивание.
В целом интерес к твёрдофазным процессам обусловлен их некоторыми преимуществами по сравнению с процессами, осуществляемыми в жидкой фазе. В числе преимуществ можно назвать следующее:
1. Твёрдофазная ферментация требует меньшие затраты энергии и на оснащение и эксплуатацию
2. Характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта
3. Низкое содержание воды препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой
4. Твёрдофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду больших количеств сточных вод.
Однако на названные преимущества существуют и некоторые проблемы, связанные с отсутствием хорошего перемешивания продуцента, поэтому он растёт в виде колоний и лишь постепенно может распространяться по субстрату; при этом возникает локальная недостача питательных веществ. При этом часть субстрата вообще не используется продуцентами
III. ТИПЫ И РЕЖИМ ФЕРМЕНТАЦИИ
Существуют 2 основных типа ферментации – периодическая ферментация (или закрытая система) и непрерывное культивирование (или открытая система).
При периодической ферментации все необходимые ингредиенты вносятся до начала процесса, в ходе культивирования питательные вещества не добавляются и параметры ферментации не меняются; именно поэтому процесс называют закрытой системой; когда образуется достаточное количество продукта, процесс останавливают, содержимое ферментера выгружают, выделяют продукт, выбрасывают использованные микроорганизмы, чистят ферментер и загружают его для нового культивирования.
Непрерывное культивирование представляет собой продолжительную долговременную операцию, занимающую много недель, в ходе которой питательные вещества добавляют в среду по мере их расходования, а излишек культуры отбирают; не смотря на то, что данный тип ферментации является близки к естественным условиям, как, например, в кишечнике животные, непрерывное культивирование имеет ограниченное применение, в частности используется при производстве белка рутина из бактерий: продолжительность ферментации – 100 дней, а производительность – 150 тонн в день. Непрерывное культивирование пока не находит широкого применения, однако в настоящее время всё более популярным становится применение компромиссной системы между двумя типами ферментации, а именно использование периодического культивирования с добавление субстрата в определённый промежуток времени, при этом период роста продуцента удлиняется за счёт того, что питательные вещества добавляются в низких концентрациях в процессе ферментации, а не вносится в питательную среду до начала процесса. Одним из преимуществ комбинированной системы является регулирование скорости роста, который соизмеряют со скоростью подачи кислорода. Обычно этот процесс используется в производстве дрожжевых клеток в пекарной промышленности. Если к дрожжевым клеткам добавляют много сахара, то они начинают дышать анаэробно и образуют вместо биомассы спирт. Широко используется периодическое культивирование и в производстве антибиотиков.
Во время культивирования микроорганизмы поддерживаются в экспоненциальной фазе роста – с этой целью в биореактор непрерывно подаётся питательная среда, при этом обеспечивается отток культуральной жидкости, содержащие микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом работы комбинированной системы является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы продуцента (в следствии деления клеток) и их убылью (в результате разбавления содержимого свежей средой).
Различают 2 режима ферментации – хемостатный и турбидостатный. При хемостатном режиме саморегулируемая система возникает в силу следующих причин:
1. Если первоначальное поступление питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в результате разбавления культуры снижается концентрация веществ, обеспечивающие ростовые процессы и скорость роста культуры повышается
2. Если увеличивающаяся культура начинает активно выедать субстрат, то это приводит к торможению роста культуры.
Конечным итого ферментации в хемостатном режиме является установление равновесия между скоростью роста культуры и её разбавления.
При турбидостатном режиме культивирование базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространённым методом её определения является светорассеивание с помощью фотоэлементов; так повышение концентрации клеток и, соответственно, оптической плотности автоматически ускоряет проток жидкости, и наоборот.
Хемостатный режим применяется в процессах, характеризующихся малым протоком, когда концентрация клеток изменяется незначительно с изменением скорости протока, что облегчает саморегулировку системы.
Турбидостатный режим используется в процессах с высокой скоростью разбавления, которые обусловливают быстрое и резкое изменение концентрации биомассы.