Введение и экспрессия рекомбинантных молекул днк в клетки реципиента

I. Генетическая трансформация прокариот

Трансформация – явление, предполагающее перенос ДНК не половым путём от клеток донора к клеткам реципиента.

Для прокариот разработаны методы трансформации, основанные на переносе изолированной ДНК и методы трансдукции, основанные на переносе генов с помощью бактериофага. Наибольшую разновидность имеют методы трансформации. К ним относят методы:

- прямого переноса генов, включающие конъюгацию, упаковку в липосомы (сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов; создают искусственно путём встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов; в липосомы заключают плазмидную векторную систему и трансформируют клетки прокариот), электропорации – основан на повышении проницаемости клеточной стенки бактерий для векторной системы за счёт действия импульсов высокого напряжения.

II. Методы трансформации растительных клеток

Различаются в зависимости от реципиетного организма (однодольные или двудольные растения). Для двудольных растений самым распространённым методом трансформации является метод кокультивирования с агробактерией. Однако для однодольных растений он не применим, поэтому разработаны ряд методов трансформации для доставки векторных систем как в клетки, так и в протопласты; относятся методы прямого переноса генов (метод трансформации протопластов, метод микроинъекции, метод электропорации, метод упаковки в липосомы); кроме применяется метод биобаллистической трансформации.

Названные методы применяются как для трансформации клеток однодольных, так и двудольных растений.

Ограничением на использование этих методов у растений является возможность регенерации растений из клеток и протопластов.

III. МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК В КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ

Разработанный ещё в 80-е годы метод микроинъекции животных клеток для переноса векторной системы остаётся до сегодняшнего дня основным и практически единственным методом трансформации. Этот метод имеет один большой недостаток – эффективность/производительность.

IV. ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ И ПУТИ ИХ ПРЕОДОЛЕНИЯ

1. Введение в геном реципиентных клеток больших (более 10000 пар нуклеотидов) генов или несколько функциональных генов; решается путём разработки новых типов векторных систем с большой ёмкостью.

2. Придание трансгенным организмам количественных признаков, поскольку они контролируются несколькими генами; не решена.

3. Экспрессия генов эукариот в клетках прокариот; порождена различной структурой генов (экзон-интронной у эукариот и экзонной у прокариот), а также различные конструкции промоутеров, запускающие процесс экспрессии генов.

4. Регуляция интенсивности экспрессии трансгенов, связанная с чрезмерной работой гена, которая приводит к истощению ресурсов реципиентной клетки и даже её гибели, поэтому пытаются регулировать экспрессию трансгенов путём изменения температур.

Прикладные аспекты генетической инженерии

I. ЭТАПЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ

1. Выбор гена и его клонирование

2. Подбор генотипа реципиента

3. Введение гена и его экспрессия в геноме реципиента

4. Особенность этого этапа связана с объектом – может быть культивирование клеток бактерий на питательных средах или регенерация растений из трансформированных клеток или развитие эмбриона в матке суррогатной матери

5. Отбор трансгенных организмов

Выбор гена зависит от целей и задач генно-инженерного исследования. Этот ген может быть достаточно удалённым от генотипа реципиента. Тем не менее генетическая инженерия обладает возможностью осуществления его экспрессии в чужеродном геноме.

Рассмотрим задачи генетической инженерии на примере создания принципиально новых форм растений (трансгенных растений).

Россия занимает 2 место (после Китая) по производству картофеля. Ежегодно народонаселением России потребляется 35 млн тонн картофеля, стоимость которого составляет 7 млрд $. При этом потеря урожая составляет: от вредителей – 18%, от болезней – 16%, от сорняков – 2%. Ежегодный займ России в МВФ составляет 2,8 млрд $.

Задачи:

1. Повысить пищевую ценность с/х растений и декоративные качества культурных растений

2. Повысить устойчивость трансгенных растений к гербицидам, вредителям, патогенам и неблагоприятным условиям окружающей среды

3. Сократить сроки выведения новых сортов

4. Уменьшение старения растений

5. Снизить технологические затраты при выращивании с/х растений и сделать растениеводство более экономически выгодными.

Формальной датой рождения генетической инженерии растений является создание с помощью Ti-плазмидного вектора химерного растения санбин, полученного при переносе гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника.

1983 год – получены первые трансгенные растения табака, устойчивые к гербицидам.

1986 год – проведены в США первые успешные полевые испытания этих растений.

1994 год – после прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность в США появились в продаже первые трансгенные продукты: томаты с замедленным созреванием и гербицид-устойчивая соя.

В настоящее время более 40 видов генетические изменённых растений томатов, кукурузы, картофеля, сои, табака, рапса и других. Список трансгенных растений с новыми признаками и качествами с каждым годом расширяется.

В РБ работы по созданию трансгенных растений ведутся в небольшом объёме. Эти работы направлены на создание трансгенных растений табака, как модельного объекта, и трансгенных растений картофеля. Создаются растения для биоремедиация, т.е. способные расти на почвах, загрязнённых тяжёлыми металлами и нефтепродуктами.

Особый интерес представляет возможность создания трансгенных растений, синтезирующих белок цитохром, который катализирует превращение холестерина в прегнеголохолестерин – предшественник стероидных гормонов у животных. В качестве реципиетного растения используется рапс.

Перспективность трансгенных растений связана с:

1. Созданием новых ценных сортов растений, устойчивых к различным заболеваниям и неблагоприятным факторами внешней среды

2. Разработкой методов биологической фиксации азота

3. Повышением продуктивности с/х культур

4. Увеличением производительности на тех же площадях пахотных земель

5. Уменьшением ущерба окружающей среде от использования ядохимикатов

6. Экономическая выгода

II. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К БИОБЕЗОПАСНОСТИ БИОИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

В РБ, как и в других странах, имеется законодательная база, регулирующая вопросы биобезопасности:

1. Постановление Совета министров РБ от 19.06.1998 «О создании национального координационного центра биобезопасности»

2. Закон РБ от 6.05.2002 «О присоединении РБ к Картафенскому договору по биобезопасности, к Конвенции о биологическом разнообразии»

3. Закон РБ от 29.06.2003 «О качестве и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов для жизни и здоровья человека»

III. НЕРЕШЁННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

1. Перенос более одного трансгена в клетки реципиента

2. Придание или улучшение у трансгенных растений количественных признаков

3. Экспрессия эукариотических генов в прокариотических организмах, и наоборот

4. Проблема создания векторов для трансформации клеток животных

5. Замолкаемость трансгенов в трансгенном геноме через некоторое время