Сиквенирование фрагментов днк

Сиквенирование – определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК с помощью одного из двух методов:

1. Химический метод/метод Максама-Гильберта (1977)

Основан на избирательной химической модификации оснований нуклеотидов, которые приводит к их разрушению.

Перед началом сиквенирования во фрагмент ДНК вводят радиоактивную метку, а затем проводят в 4 пробирках реакции по разрушению одного из 4 нуклеотидов. Результаты реакции каждой из пробирок подвергают электрофорезу. На электрофореграмме определяют на каком расстоянии от радиоактивной метки находится соответствующий нуклеотид, используя данные по разделению фрагментов ДНК в зависимости от их молекулярной массы.

2. Ферментативный метод/метод Сэнгера (1977)

Основан на репликации комплементарной цепи ДНК на одноцепочечной ДНК-матрице при происходящим в разных местах строящихся последовательностях ДНК обрыве синтеза. Обрыв синтезируемой цепи ДНК происходит путём введения терминирующих нуклеотидов. Терминирующими нуклеотидами являются дидезокситрифосфаты, которые не могут сформировать ковалентную связь со следующим нуклеотидом, поэтому происходит обрыв синтеза. Сиквенирование производят также в 4 пробирках, а результаты разделяют с помощью электрофореза, по которому и считывают нуклеотидную последовательность.

Технология рекомбинантных днк

I. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

Рекомбинантная ДНК – гибридная ДНК, полученная в результате объединения 2 фрагментов (обычно чужеродных) ДНК.

1. Этап создания рекомбинантных ДНК

- выделение ДНК из клеток донора

- подготовка ДНК к клонированию

- сиквенирования фрагментов ДНК

- конструирование рекомбинантных ДНК

2. Этап введения и экспрессии рекомбинантных ДНК в клетки реципиента

- трансформация реципиентных клеток рекомбинантными ДНК

- отбор трансформированных клеток с помощью маркеров

- получение экспрессируемого белкового продукта и его анализа

- промышленное получение полипептидного препарата и его тестирование

II. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЕКТОРОВ

Вектор – молекула ДНК, способная акцептировать чужеродный фрагмент ДНК и обеспечить его репликацию, экспрессию и/или трансформацию.

Векторы, применяемые в генетической инженерии прокариот:

- плазмидные

- фаговые

- плазмидно-фаговые (космиды и фазмиды)

Общая характеристика векторов будет рассмотрена на примере плазмидного вектора.

Плазмидный вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК и построен на основе плазмиды (внехромосомного элемента бактериальной клетки). Вектор должен обладать:

1. Определённым размером – физическая величина, характеризующая длину его молекулы

2. Определённой ёмкостью – размером фрагмента ДНК, который может акцептировать векторной системой

3. Возможностью самореплицироваться

4. Вектор должен иметь маркерный ген

Первая векторная система для прокариот – pSC101 – была предложена для бактерий (всегда есть буква p – плазмидный вектор); примитивная, с 1 маркерным геном, с 1 сайтом рестрикции EcoR1. Его сменил вектор pBR322 – вторая векторная система; 2 маркера, множество сайтов рестрикции и наличие точки начала репликации. Современная векторная система – pUC – отличается от предыдущих наличием полилинкера (фрагмент ДНК, содержащий большое количество сайтов рестрикции для различных рестриктаз) и объединяет плазмидные векторные системы, содержащие ori-сайт – точка начала репликации плазмидной векторной системы в определённой бактериальной клетки, из которой была выделена плазмида (послужившая основой для создания плазмидного вектора).

Фаговая векторная система построена на основе ДНК бактериофага; отличается от плазмидной большей ёмкостью, т.е. может включить в свой состав чужеродную ДНК большей длины (до 20000 пар нуклеотидов).

Принципиальное строение фагового вектора сходно со строением бактериофага, т.е. имеется белковый капсид, внутри которого заключена векторная система, которая сама и производит белковый капсид, т.к. в ДНК вектора содержится левая и правая флангирующие последовательности, кодирующие белковый капсид и упаковку ДНК внутри белкового капсида.

Плазмидно-фаговые векторные системы

Гибридные векторные системы, которые подразделяются на космиды и фазмиды. Созданы с целью клонирования и трансформации генов большой длины (в среднем 40000 пар нуклеотидов).

1. Космиды

Характеризуются плазмидным типом репликации и обладают способностью упаковываться (в условиях in vitro) в головке фага λ. По существу космиды являются плазмидными векторами, имеющими лишь флангирующие последовательности – cos-участки – от бактериофага.

2. Фазмиды

Истинные гибриды плазмиды и фага, на концах которых расположены сегменты ДНК фага, а средняя часть представлена плазмидной ДНК. Фазмиды могут реплицироваться и как плазмиды, и как фаги.

Единственным ограничением на использование гибридных векторных систем является способность ДНК упаковаться в головку фаговой частицы.

Проблемы создания векторов для генетической инженерии растений

Проблема создания векторов для клеток растений была решена при исследовании заболевания корончатый галл у высших растений.

Причиной данного заболевания является бактерия Agrobacterium tumefaciens, обитающая и ризосфере растений. Эта бактерия содержит Ti-плазмиду, структура которой следующая:

Состоит из 2 диаметров. В составе Т-ДНК – имеет левый (Left Border) и правый (Right Border) фланги; 3 гена – гены ауксина (Auxin), цитокинина (Cytokinin) и опина (Opine).

Opine Catabolism – зона катаболизма опина

ORI-сайт – точка начала репликации клеток агробактерии.

Virulance Region (VIR) – вирулентная область; в VIR-области находится 7 генов, которые отвечают за вырезание T-области ДНК, перенос её в геном растительной клетки, а также кодировку рецепторных белков, улавливающих раневые вещества, выделяемы растением.

Для использования Ti-плазмиды в качестве векторной системы производят её модификацию и чужеродный ген размером 40000 пар нуклеотидов встраивают вместо имеющихся генов T-области. В настоящее время с целью переноса генов большего размера созданы следующие векторные системы:

1. Коинтегративный вектор – состоит из 2-х объединённых векторов: плазмидного вектора pBR322 и неонкогенной Ti-плазмиды.

Недостаток – может быть применима только для трансформации некоторых видов растений.

2. Бинарный/челночный – состоит из 2 необъединяющихся векторов – собственно бинарного вектора (является клонирующим вектором) и неонкогенный тип плазмиды (является вектором-помощником).

Все стадии клонирования проводят в кишечной палочке, что намного упрощает весь процесс, а затем вектор вводят в агробактерию, в которой содержится неонкогенная Ti-плазмида, содержащая только ori-сайт и гены VIR-области. После этого происходит трансформация растительных клеток.

Вектора для трансформации растительных клеток создаются не только на основе Ti-плазмиды, но и на основе Ri-плазмиды, а также на основе ДНКовых вирусов растений, в частности вируса табачной мозаики, мозаики цветной капусты и других.

Ретровирусные вектора для клеток животных

Для клеток животных организмов не найдены природные плазмидные системы, поэтому вектора разрабатываются только на основе вирусов как ДНКовых, так РНКовых. В частности в качестве объектов используются ретро-вирусы – РНК-содержащие вирусы, папилломы простого герпеса. ДНК этих вирусов изменяют (избавляют от инфекционности) и производят встраивание нужного исследователю гена.

В настоящее время существую достаточно много проблем по производству векторных систем для трансформации клеток животных.