Лигазы и процесс лигирования

Лигирование – процесс восстановления фосфоэфирных связей между соседними нуклеотидами с помощью лигаз.

1961 год – Мезейсон и Вейдон на примере фага λ показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединения фрагментов ДНК. Это послужило началом поиска ферментов, участвующих в сшивании ДНК.

1967 год – фермент найден и назван лигаза.

ДНК лигазы в отличие от рестриктаз являются универсальными, т.е. способны образовывать связи между сахарофосфатными остовами 2 ДНК различного видового происхождения. В норме в клетке ДНК-лигаза участвует в процессе репликации, сшивая синтезированные цепи ДНК.

В генетической инженерии используется 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в ко-факторах – ДНК-лигаза фага T4 и ДНК-лигаза E. coli. ДНК-лигаза E. coli в качестве ко-фактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а ДНК-лигаза фага T4 – АТФ в присутствии ионов Mg (является более универсальной, т.к. способна соединять фрагменты как с липкими концами, так и с тупыми).

Для сшивания фрагментов РНК пользуются РНК-лигазой фага T4. Её выделяют из клеток E. coli при заражении фагом T4. Для работы РНК-лигазы в качестве ко-фактора необходима АТФ. Акцептором в реакции лигирования служит полностью дефосфорилированный участок, а донором – полностью фосфорилированный концевой участок РНК.

Соединение фрагментов ДНК с одноимёнными липкими концами чаще происходит с помощью ДНК-лигазы E. coli. Сшивание фрагментов ДНК с разноимёнными липкими концами, которые образовались под действием различных рестриктаз, производят одним из 2 способов, приводящих к затуплению разноимённых липких концов.

По первому способу затупление происходит с помощью нуклеаз, разрушающих одноцепочечные концевые участки. По второму способу – с помощью полимераз, которые достраивают по принципу комплиментарности вторую цепь на матрице выступающего участка.

Сшивание фрагментов с тупыми концами осуществляется с помощью ДНК-лигазы фага T4, однако в этом случае скорость лигирования на порядок ниже, чем при сшивании с липкими концами.

11.03.2014; Лекция 4/15

Полимеразы

Полимеразы – ферменты, осуществляющие матричный процесс копирования нуклеиновых кислот.

Различают ДНК-полимеразу, которая осуществляет синтез новой цепи ДНК на матрице ДНК. Применяется ДНК-полимераза в полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую используют в генетической инженерии для амплификации ДНК.

Амплификация – наработка ДНК во множестве копий. Для амплификации используется ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquaticus.

В клетках в норме ДНК-полимеразы участвуют в таких матричных процессах, как: репликация ДНК, репарация ДНК.

Кроме ДНК-полимераз в генетической инженерии используется РНК-полимераза, которая способна осуществлять как в условиях in vivo, так и в условиях in vitro процесс транскрипции. Используется в редких случаях, более часто используется фермент РНК-зависимая-ДНК-полимераза (обратная транскриптаза/ревертаза) для ферментативного синтеза генов на матрице РНК.

Выделение днк из клеток донора; банки генов и клонотеки геномов

В настоящее время существуют 4 способа получения молекулы ДНК, а также фрагментов ДНК и генов:

1. Химический синтез: впервые синтез гена фенилаланиновой транспортной РНК дрожжей длиной 77 пар нуклеотидов был осуществлён в 1968 году в лаборатории Кораны; синтез генов возможен благодаря ДНК-синтезаторам, известной нуклеотидной последовательности гена, наличия соответствующих реактивов и прибор «ДНК-синтезатор»; химический синтез применяется успешно для синтеза коротких фрагментов ДНК (20-30 пар нуклеотидов) т.н. ДНК-зондов.

2. Ферментативный синтез: осуществляется с помощью фермента обратной транскриптазы на матрице однонитчатой РНК; ограничением использования этого метода является доступность зрелой и-РНК соответствующего гена.

3. Выделение из клеток донора: наиболее распространённый способ получения ДНК из клеток различных организмов, основная технология заключается в: получении культуры клеток → получении клеточных экстрактов при осаждении культур центрифугированием → добавление к экстракту лизоцима для разрушения клеточных стенок и получения сферопластов → добавление детергента для растворения мембран и инактивации гидролитических ферментов → выделение ДНК центрифугированием; в случае работы с бактериальными клетками получают 2 фракции ДНК – ДНК лёгкая и ДНК тяжёлая, эти фракции выявляются в УФ-излучении.

4. Получение из клонотеки или геномной библиотеки: под клонотекой либо генотекой ДНК понимают совокупность комплементарных ДНК по различным генам, которые включены в состав подходящего вектора (комплементарная ДНК – ДНК, лишённая интронов); геномная библиотека включает все гены генома.

Для поиска нужного исследователю гена в геномной библиотеке или клонотеке используют ДНК-зонды – короткие одноцепочечные последовательности (20-30 нуклеотидов) с радиоактивной меткой. Принцип работы ДНК-зондов основан на комплиментарности их нуклеотидной последовательности и нуклеотидной последовательности искомого гена. Метод, с помощью которого происходит поиск нужного гена получил название Саузерн-блот-гибридизация (по имени учёного Саузерна) и был разработан в 1975 году. Этот метод позволяет найти нужный ген на нитроцеллюлозной плёнке после электрофореза фрагментов ДНК. Одноцепочечные фрагменты ДНК зафиксированы на нитроцеллюлозной плёнке с помощью высокой температуре, используются в качестве компонентов поиска с помощью молекулярного зонда, который способен гибридизоваться только с определённым комплементарным фрагментов ДНК. Фрагмент, с которым связался зонд, выявляется радиоавтографией. По полученным результатам судят о присутствии интересующего гена в анализируемом геноме либо производят отбор этого гена.