7.03.2014; Лекция 3/15

Задачи генетической инженерии:

1. Выделение, конструирование и клонирование новых рекомбинантных генов и молекул ДНК

2. Введение в геном реципиентной клетки одного или нескольких обычно чужеродных генов, либо создание в геноме новых типов регуляторных связей

3. Создание банка генов

Для решения этих задач в генетической инженерии разработаны следующие методы:

1. Методы переноса генов в различные организмы

2. Методы рекомбинации и конструирования очищенных из клеток генов

3. Методы переноса генов в клетки различных организмов

В настоящее время генетическая инженерия подразделяется на 2 направления: генная и геномная инженерии.

Поскольку геномная инженерия направлена на конструирование геномов, находится на стадии накопления экспериментального материала, поэтому генную инженерию называют генетической.

IV. ИНСТРУМЕНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕНРИИ

К инструментам относят различные ферментные системы, которые лишены видовой специфичности, поэтому их можно использовать для работы с нуклеиновыми кислотами организмов различных таксономических групп и, тем самым, преодолевать барьеры межвидовой несовместимости.

Ферменты делятся на 3 группы:

1. Ферменты, с помощью которых происходит разделение молекулы ДНК на фрагменты – рестриктазы.

2. Ферменты, необходимые для восстановления ковалентных связей между нуклеотидами фрагментов с образованием целостной структуры – лигазы.

3. Ферменты, необходимые для наработки молекул ДНК на матрице ДНК – полимеразы.

3.1. Обратные транскриптазы – разновидность полимераз, осуществляющие наработку фрагментов ДНК на матрице и-РНК.

Рестриктазы: их основные характеристики и механизмы функционирования

Впервые были выделены в 1968 году Арбером из клеток бактерий, в которых они являются эндонуклеазами и выполняют так называемую функцию внутриклеточной иммунной защиты. В связи с этим рестриктазы являются уникальными, поскольку могут отличать ДНК бактериальной клетки, в которой находятся, от чужеродной ДНК, проникающей в эту клетку. В связи с этим рестриктазы были названы, исходя из латинского названия бактерии, из которой они были выделены.

Escherichia coli – EcoR1 (Eco – первая буква рода и первые две буквы вида, R – рестриктаза только для E. coli, 1 – номер);

Thermus aquaticus – TaqI (I – латинская цифра).

Рестриктазы классифицируются на 3 типа, однако в генетической инженерии используются рестриктазы только 2-го типа, поскольку только у них сайт узнавания совпадает с сайтом рестрикции.

Сайт рестрикции – место/участок молекулы ДНК, в котором происходит разрыв фосфоэфирных ковалентных связей между соседними нуклеотидами, в результате чего ДНК разделяется на фрагменты.

Сайт рестрикции EcoR1 – 6 нуклеотидов:

– Г↓ААТТЦ – (1/4)⁶ = 1/4096

– ЦТТАА↑Г –

Сайт рестрикции TaqI – 4 нуклеотида:

– ТЦ↓ГА – (1/4)⁴ = 1/256

– АГ↑ЦТ –

Характеристика сайтов рестрикции:

1. Для каждой рестриктазы свой сайт рестрикции

2. Сайты рестрикции представляют собой палиндромы, т.к. их нуклеотидная последовательность в каждой цепи читается одинаково при повороте на 180 градусов.

3. В зависимости от величины получаемых фрагментов рестриктазы 2 типа подразделяются на мелкощепящие, средещепящие и крупнощепящие. Отнести определённую рестриктазу к одному из этих классов можно путём подсчёта вероятностей встречаемости соответствующих нуклеотидов в их сайтах рестрикции.

Расчёт средней длины фрагмента:

(1/4)ⁿ

n – число пар нуклеотидов в сайте рестрикции.

4. В зависимости от мест разрывов ковалентных связей в сайте рестрикции рестриктазы делят на дающие фрагменты с липкими концами и дающие фрагменты с тупыми концами.

– Г↓ААТТЦ – → – Г + ААТТЦ –

– ЦТТАА↑Г – → – ЦТТАА + Г –

Фрагменты с липкими концами

Липкие концы представляют собой выступающие одноцепочечные участки

– ТЦ↓ГА – → – ТЦ + ГА –

– АГ↑ЦТ – → – АГ + ЦТ –

Фрагменты с тупыми концами

Ферментная активность рестриктаз измеряется в единицах активности показывающих, какое количество фермента необходимо для полного гидролиза за один час одного микрограмма ДНК фага λ при оптимальных условиях.

…, и зависят от pH, ионной силы раствора, температуры