51.Использование рск при лабораторной диагностике вирусных инфекций.

РСК в вирусологии используется для серодиагностики вирусных инфекций, а также для определения вирусспецифических антигенов в различных материалах, полученных от больных, т.е. для идентификации вирусов.

Для проведения РСК необходимо 2 системы: 1) АГ, АТ, комплемент, 2) эритроциты барана и гемолитическая сыворотка.

Специфическое взаимодействие АТ с АГ сопровождается связыванием комплемента. Гемолитическая система показывает фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если АГ и АТ соответствуют друг другу, т.е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза эритроцитов не происходит. Если же АТ и АГ не соответствуют друг другу, то не происходит образования иммунного комплекса, и, соответственно комплемент не связывается и оставаясь свободным он связывается с гемолитической системой, вызывая гемолиз эритроцитов.

Особенности РСК в вирусологии: осуществление связывания комплемента на холоде (+4гр.), а также включение дополнительного контроля с так называемым нормальным АГ (АГ из клеток, в котрых репродуцировался вирус)

Результат опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

52.Постановка реакции нейтрализации и цветной пробы.

РН: основана на нейтрализации инфекционной активности вирусов при связывании со специфическими противовирусными антителами. РН используется для идентификации выделенных вирусов, т.е. для определения видовой и типовой принадлежности вируса.

Постановка: РН воспроизводится в чувствительных к вирусу живых системах.

Из вируссодержащего материала готовят серийные разведения, добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вирус-сыворотка инкубируют 30-60 мин. при 37 гр. Для обеспечения связывания АГ с АТ. Затем, смесью заражают культуру ткани, куриные эмбрионы, лабораторных животных. Контролем служит чувствительная система зараженных вирусом без сыворотки.

Учет. Положительный результат: нейтрализация ЦПД (отсутствие дегенеративных изменений) в культуре клеток, патологических изменений в куриных эмбрионах или организме животных. Отрицательный результат: наличие ЦПД, следовательно вирус не был нейтрализован.

Индекс нейтрализации-отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте. Если ИН менее 10- реакция отрицательна, от 11-49- сомнительная, выше 50- положительная.

Вариант РН- подавление вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки. Постановка. К вируссодержащему материалу добавляют антисыворотку. Инкубация 30-60 мин. Затем смесь наносят на монослой чувствительных культур клеток. Затем покрывают тонким слоем агара. После инкубирования посевов в течение суток на поверхности агара появляются просветленные участки определенной формы (бляшки), представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое культуры клеток. Титр вируса, установленный этим методом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Цветная проба- вариант РН. В результате жизнедеятельности клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты. В результате цвет входящего в состав среды индикатора (фенолового красного) становится оранжевым. При заражении культуры клеток цитопатогенными вирусами метаболизм клеток подавляется, рН среды и ее цвет не изменяются, она остается красной.

Постановка. В пробирки вносят по 0.25 мл рабочего разведения вируса и соответствующего разведения сыворотки. Смесь выдерживают при комнатной температуре 30-60 мин., добавляют в пробирки по 0.25 мл клеточной суспензии, закрывают пробирки пробками. Термостат 6-8 дней при 37 гр. Учет рН 7.4 и выше- репродукция вируса, 7.2 и ниже- нейтрализация антителами.