Классификация векторных молекул для бактериальных клеток в зависимости от цели клонирования.

1. Векторы для амплификации – для увеличения количества копий генов.

2. Векторы для секвенирования – определение нуклеотидной последовательности.

3. Векторы интегративные – обеспечивают встраивание чужеродного объекта в др. репликон (х).

4. Векторы челночные – могут существовать в клетках различных хозяев (бактерии/дрожжи).

5. Векторы секретирующие – обеспечивают выделение нужных продуктов из клетки.

6. Векторы эксперессирующие – обеспечивают мах. возможную продукцию искомого продукта.

Эти векторы конструируют т. о., чтобы нужный ген отвечал за образование искомого продукта, находился под контролем сильного промотора и чтобы он находился в состоянии многокопийной плазмиды. Сильный промотор, оперон группы структурно-функциональных генов, отвечает за образование одного продукта или проявление одного свойства. Выделяют 2 области:

А. промоторно-операторная – регуляторная, с ней происходит связывание РНК-полимеразы и дальнейшее образование м-РНК, которая соответствует области структурных генов.

Б. область структурных генов – к 80-м гг. ХХ в. была расшифрована последовательность этих областей различных генов. Оказалось, что существуют сильные промоторы эффективно связывающие РНК-полимеразу. При их использовании образуется большое количество м-РНК, транслируемые в соответствующий продукт.

В составе промоторно-операторной области есть 2 функционально важных участка для связывания м-РНК. +1 – начинает связываться м-РНК. На расстоянии от +1 есть область -10 и -35 нуклеотидов. В области -35 нуклеотидов ок. 9 из них принципиально важны для связывания РНК-полимеразы. Наиболее сильна область из промотора лактозного оперона. В области -10 принципиальным явл. наличие 6 нуклеотидов. Их последовательность консервативна, это называется ТАТААТ. Эта последовательность называется Прибнов-бокс. Наиболее сильна в области триптофанового оперона. Т. о. был сконструирован искомый сильный промотор из фрагментов лактозного и триптофанового оперонов (ТАТ). При его использовании наблюдается повышенная экспрессия генов, расположенных на этих оперонах. При использовании таких промоторов можно регулировать их экспрессию. Можно выращивать культуры мах. плотности, при изменении t можно вызывать экспрессию исследуемых генов.

По их поиску векторы м. б. прямой и непрямой селекции.

Векторы прямой селекции – получаются на основе плазмиды ColE1. Образование колицинов для некоторых клеток явл. летальным. Поэтому, если встраивание чужеродной ДНК производится в гены связанные с образованием колицинов, то после их введения в клетку выживают только те из них, которые характеризуются отсутствием способности к синтезу колицинов.

Векторы непрямой селекции – оцениваются после введения. В молекуле изменяется какое-то фенотипическое свойства (отсутствие продукции пигмента).

Способы соединения векторных молекул и клонируемых фрагментов.

Векторные молекулы и клонируемые фрагменты м. б. получены с использованием одной рестриктазы. Тогда они имеют одинаковые «липкие концы» и в присутствии ДНК-липаз они легко соединяются м/у собой по принципу коплементарности липких концов - лигирование.

Чаще их получают с разными рестриктазами, т. е. концевые фрагменты не комплементарны. Поэтому были разработаны 3 подхода их соединения.

Линкерный мол – короткая последовательность ДНК (6-12 пар оснований синтезированных искусственно), внутри себя содержат сайты узнавания для одной или нескольких рестриктаз. При использовании высоких концентраций фермента ДНК-лигаза, такие линкеры пришиваются с обеих сторон к клонируемому фрагменту. Затем такая ДНК обрабатывается этой рестриктазой, образуется однонитевые фрагменты, которые можно соединять с векторной молекулой, полученной этой же рестриктазой.

Полилинкеры – несколько сайтов узнавания рестриктаз.

Адаптеры – искусственно синтезированный однонитчатый фрагменты ДНК, которые используются для соединения фрагментов с несовместимыми концами, полученными с помощью различных рестриктаз. Для использования адаптеров необходимо знать липкие концы.

Коннекторы – используются для соединения фрагментов. К одному добавляется тимин, к др. – аденин. После объединения, в присутствии ДНК-полимераз, ДНК-лигазы возможно объединение фрагментов за счет комплементарных нуклеотидов.

Векторы получаемые на основе плазмидных ДНК. Преимущества.

• Эти векторы способны к стабильному поддержанию в клетке хозяина;

• Легкость выделения из клетки плазмидных ДНК и простота методов генетических манипуляций;

• Наличие многих способов для введения плазмид в клетки;

• Многокопийность плазмид;

• Наличие сайтов узнавания для многих рестриктаз;

• Различие в размерах, что дает возможность клонировать фрагменты различной длины – мах. 7-8 тыс. пар оснований.

pBR322 – небольшой размер (ок. 4000 пар оснований), нуклеотидная последовательность полностью установлена. Эта плазмида способна к амплификации, имеет сайты узнавания для 12 различных рестриктаз. Имеет селективные маркеры (устойчива к ампициллину и тетрациклину), что позволяет проводить клонирование именно в эти сайты. Маркеры резистентности к антибиотикам не явл. транспозонами и не могут передаваться в др. репликоны. Плазмида легко выделяется из клетки и может с высокой частой вводиться в реципиентные клетки путем трансфузии.