Методы выделения генов.
Химико-ферментативный синтез генов.
Осуществлен впервые в 1976 г. Гобином Корана. Это был ген, отвечающий за образование в генах дрожжей т-РНК для тирозина. Последовательность из 192n нуклеотидов.
Наиболее часто этот способ используется для генов небольших размеров, для продуктов которых установлена аминокислотная последовательность. В настоящее время синтезируется ген инсулина – 415 пар оснований.
Сначала устанавливается последовательность аминокислот в белковом продукте с учетом вырожденности генетического кода. синтез коротких (10-15 пар нуклеотидов) однонитевых комплексов фрагментов:
│ 1 │ │ 3 │ │ 1 │ │ 3 │
│ 2 │ │ 4 │ │ 2 │ │ 4 │
Затем такие синтезированные фрагменты смешиваются м/у собой, добавляется АТФ, изомераза, липаза. За счет случая идет объединение объектов. В результате в смеси продуктов реакции м. б. получены и интактные (необходимые) гены.
Возможно определить не только последовательность аминокислот в белке, но и нуклеотидную последовательность в ДНК. Этот процесс называется – секвенированием.
Выделение генов из природных (нативных) днк.
Шот-ган клонирование, метод «дробовика» - используется гидродинамическое воздействие на НК, либо рестриктазы II класса. В результате соединения выделенных фрагментов ДНК с векторными молекулами образуется банк генов (библиотека) ДНК. Задача банка генов – представить количество клеток, в которых содержаться все гены данного организма в составе векторных молекул или рекомбинантных ДНК. Совокупность всех генов E. coli при использовании как вектора плазмиды Со/Е1 – составляет 1000 клеток. для млекопитающих ок. 1 млн. для обнаружения всей или большей части их генов. Метод дешевый, простой, но:
Трудно подобрать такой способ воздействия на ДНК, чтобы м. б. выделить интактный активный ген.
При клонировании генов эукариот в клетках бактерий не происходит удаление интронов.
Если размеры гена малы, то возникают сложности с его обнаружением в клетке.
Синтез гена на м-рнк, как матрице (получение комплемента (к- днк).
На первом этапе из клетки выделяется м-РНК, которая синтезируется в клетках, находящихся на определенной стадии роста. Или на определенных типах тканей.
м-РНК
АААА
образование транскрипта ↓ полиаденилированный участок
м-РНК ААА
ДНК
↓ДНК-аза
к-ДНК
К м-РНК добавляются тиминовые нуклеотиды и обратные транскрипты. На м-РНК с использованием полиадениловых фрагментов, как начало матрицы и за счет синтеза обратной транскриптазы образуется комплементарная ДНК. На следующем этапе используется щелочной гидролиз или РНК-аза, удаляющие нить м-РНК. Образуется 1-нитевая ДНК. После этого в присутствии НК, фермента ДНК-полимеразы и Лигазы на нити ДНК как на матрицу синтезируется комплементарная цепь.
М/у 2 и 3 процессами существует разница. В случае комплементарной ДНК получаются части генома, которые транскрибировались в м-РНК в данный тип клеток и в данный конкретный момент времени. Создается банк генов комплементарных ДНК. При использовании 2 способа мы имеем набор последовательности ДНК, соединенной с вектором.
Векторные молекулы – это молекулы ДНК способные переносить и стабильно поддерживать в реципиентной клетке чужеродную генетическую информацию. Вектором м. б. ДНК плазмид, вирусов, в т. ч. фагов. Векторы обладают следующими свойствами:
Вектор должен быть репликоном и стабильно поддерживать в клетке, т. е. он должен распространятся в клетке как хромосомы в бактерии;
Вектор должен иметь селективный маркер, позволяющий определить его наличие в реципиентной клетке (устойчивость к антибиотикам;
Вектор должен иметь небольшое количество сайтов узнавания рестриктаз. Но количество рестриктаз должно быть мах. разнообразным.
Емкость вектора – размер чужеродной ДНК, которую он может переносить без потери стабильности клетки. Фрагменты очень большого размера, вводимые в клетки теряются.