2. Выделение чистой культуры.

Используется метод изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде посевом штрихом или разливом по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Но получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, т. к. колони могут вырасти из скоплений разных видов. Если м/о образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду, т. к. на ней лучше растут контаминирующие м/о и их легче обнаружить.

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси м/о шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток м/о каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.

Рассев шпателем (метод Коха):

• На поверхность питательной среды в чашке №1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

• Чашку № 1 закрывают, а шпатель переносят в чашку №2 не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

• Тоже в чашке № 3. после чего шпатель стерилизуют;

• Чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной t;

• Ч/з определенное время чашки достают из термостата и изучают рост м/о. Обычно в чашке №1 наблюдается сплошной рост, в №№ 2,3… - формируются изолированные культуры.

Рассев петлей (метод истощающего штриха):

На агаризированную среду в чашки Петри бактериологической петлей идет высев из накопительной культуры. На 1-м этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов. Петлю стерилизуют, остужают и проводят ряд штрихов перпендикулярно первым. 3-й перпендикулярно 2-м, 4-й – 3-м. Чашки помещают в термостат и ч/з определенное время учитывают результат. Обычно на 1-2 серии штрихов наблюдается большое число колоний, а на 3-4 – изолированные.

Последовательные разведения в твердой среде.

После инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15-20 мл среды, перемешивают покачиванием. Иногда отдельные колонии остаются погруженными в агар и их извлекают механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при t расплавленного агара.

3. Определение чистоты выделенной культуры.

Выросшие изолированные колонии отсевают бактериологической петлей на поверхность скошенной среды агара в пробирку. Т. к. изолированные колонии могут формироваться не только из отдельных клеток, обязательным этапом выделения чистой культуры должна быть проверка их однородности. Выделяют несколько способов:

При визуальном контроле исследуют рост культуры по штриху на поверхности скошенной среды, если рост неоднороден, считается, что культура загрязнена. При описании колоний бактерий определяют их диаметр в мм, пигментацию, форму (точечная, круглая, волокнистая, неправильная, ризоидная), высоту, профиль (высокий, плоский, выпуклый), вид края (гладкий, волнистый, лопастный, зубчатый, волокнистый, складчатый и др.). Поверхность (гладкая, блестящая, шероховатая, тусклая, неровная, гранулированная матовая, мукоидная, слизистая. Степень прозрачности колоний (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные), консистенция при проверке иглой (маслянистая, вязкая, сухая).

Микроскопия клеток. Готовится препарат фиксированных окрашенных клеток, который микроскопируется с иммерсионным маслом. Клетки чистых культур однородны по размеру и окраске по Граму. Но колонии в чистой культуре м. б. гладкими (S), шероховатыми (R), в них могут появляться кокковидные клетки, цисты, споры, возможна грамвариабельность.

Повторный рассев на селективные среды, обеспечивающие избирательный рост тех или иных м/о. критерием чистоты явл. однородность колоний.

Основная задача после ее получения – это оценка ее биотехнологического потенциала.