Монослойные культуры

Требования к поверхности субстрата. Большинство нетрансформи-

рованных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя,

будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам либо к стеклу

(алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (по-

листирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целло-

фан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пла-

стиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клет-

ки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются

к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур)

или металлу (качественная нержавеющая сталь или титан).

Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культу-

ральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхно-

стной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления

клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами

(наиболее изученным является фибронектин, присутствующий в сыво-

ротке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двух-

валентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд

поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно за-

ряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным

воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факто-

рами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электро-

статическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда

может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление кле-

ток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся

коллаген и желатин. Для этих целей используют коммерческие

препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»),

что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена

из крысиных хвостов.

Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществ-

ляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы

поверхностью до 200 см2) или пробирках для культуры тканей, обеспе-

чивающих поверхность роста 5−200 см2.

Рост клеток в монослое. В случае монослойных культур необходи-

мо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого

культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в

условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена

только от генерации, состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому

просмотр и оценка качества монослоя имеют решающее значение при

выборе культур для пересева. 55

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать

так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки

приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфи-

ческие движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следователь-

но, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение

полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений.

Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюда-

ется также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки

могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в та-

ком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. Из

сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способно-

стью снимать контактное торможение.

Снижение распластывания клеток при достижении полного моно-

слоя, а также ошаривание и прекращение роста клеток при их открепле-

нии от подложки легли в основу представлений о тесной связи распла-

стывания нетрансформированных клеток по мере их роста.

Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки,

трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более

высокой конечной плотности. Считается, что эти клетки утрачивают за-

висящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способ-

ны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не на-

ступает смена среды, то клетки быстро погибают.

Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение

в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для по-

лучения высокой плотности клеток необходима периодическая замена

питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению

состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.

Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению от стекла и

формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02 % раство-

ром химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и

0,01 % ЭДТА) происходит при комнатной температуре в течение

5−10 мин в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состоя-

ния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начина-

ет отделяться от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную

посуду заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой

тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием

способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь по-

сле подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и

используют при новых пересевах. 56

Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся пред-

посылками их широкого использования:

1) выделение секретируемого продукта многими клетками осуществ-

ляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;

2) возможность быстрой и легкой замены питательной среды, сопос-

тавления времени и количества среды с периодом роста клеток или вре-

менем наработки продукта;

3) обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в мо-

нослой могут быть введены любые типы клеток;

4) достижение искусственно высокой плотности клеток с использо-

ванием перфузионной техники;

5) возможность использования одной и той же аппаратуры с разным

отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

Однако при использовании монослойных культут выявляются и не-

достатки:

1) сложность масштабирования;

2) отсутствие информативности визуального анализа;

3) трудности с определением и поддержанием таких параметров, как

кислотность и содержание О2, и обеспечением гомогенности культуры

клеток;

4) необходимость значительных пространств.