- •Классификация продуктов биотехнологии.
- •Получение накопительной культуры.
- •Выделение чистой культуры.
- •Рассев шпателем (метод Коха):
- •Рассев петлей (метод истощающего штриха):
- •Определение чистоты выделенной культуры.
- •Основными объектами биотехнологии являются м/о т. К.:
- •Виды микроорганизмов используемые в биотехнологии.
- •Подходы к генетическому изменению объектов биотехнологии, in vivo.
- •Отбор случайных мутаций.
- •Отбор среди мутантов с определенным фенотипом.
- •Создание биологических штаммов in vitro.
- •1972 Г. – начаты исследования по ги в лаборатории Берга. Получена первая рекомбинантная днк, которая представляла собой фрагмент вируса sv 40, фрагмент e. Coli, фрагмент оперона.
- •Инструментами ги являются:
- •Методы выделения генов.
- •Выделение генов из природных (нативных) днк.
- •Синтез гена на м-рнк, как матрице (получение комплемента (к- днк).
- •Классификация векторных молекул для бактериальных клеток в зависимости от цели клонирования.
- •Клонирование в клетках Bacillus subtilis.
- •Искусственная бактериальная хромосома.
- •В молекуле на основе фаговых днк м. Б. Получены на основании 1-нитевых фагов. Это м 13, fd, f1 и др.
- •Векторы для клонирования в клетках животных.
- •Векторы для клонирования высших растений.
- •Способы введения рекомбинантных днк в клетку.
- •Культивирование биотехнологических объектов.
- •Преимущества непрерывного культивирования:
- •Твердофазная ферментация (тфф).
- •Получение белка одноклеточных организмов (боо).
- •Кормовые дрожжи.
- •В настоящее время пробиотики как биотехнологический продукт делятся на несколько типов:
- •Основы инженерной энзимологии.
- •Иммобилизированные ферменты:
- •Клеточная инженерия
- •Культуры каллусных клеток
- •Получение протопластов
- •Культивирование протопластов
- •Слияние протопластов
- •Гибридизация соматических клеток
- •Культивирование животных клеток
- •Культуральные системы животных клеток
- •50 Пересевов, которые затем трансформируются в постоянные (переви-
- •Первичные культуры
- •0,25 % Трипсин, 200−2000 ед./мл коллагеназа) дезагрегации. В случае
- •Постоянные культуры
- •1,5−3 Раза), по снижению зависимости от сыворотки и возможности под-
- •Типы культуральных систем
- •Монослойные культуры
- •Суспензионные культуры
- •0,01 % Эдта с последующим длительным периодом адаптации, сопро-57
- •Монослойное культивирование на микроносителях
- •Питательные среды
- •Клеточный цикл и цикл роста
- •24 Часа. При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно
- •Синхронизация клеток
В настоящее время пробиотики как биотехнологический продукт делятся на несколько типов:
1. Монокомпонентные – бифидумбактерин (Biphidum), бифилиз (Biphidum + органические кислоты, лизоцим). Они выпускаются в виде таблеток или суспензий. Используются при ОКИ, особенно вирусной этиологии.
2. Поликомпонентные – Линекс (ассоциация из Biphidum, Lactobacter, Enterococcus). Помимо выраженного профилактического действия он поддерживает физиологическое состояние толстого кишечника. Биоспорин (Bacillus), Бифолак (Biphidum, Lactobacter).
3. Комбинированные – несколько видов бактерий и др. БАВ – аципол (Acydophillus + органические кислоты).
Получение.
Подготовка и стерилизация питательной среды. Готовят маточную культуру. Может занимать до 10 сут.
Промышленное выращивание культуры (18-20 ч.), t 370 С. Добиваются плотности клеток 109 в 1 мл культуры.
Клетки отделяют и помещают в среду для высушивания (среда готовится из обезжиренного молока или сахаро-желатиновая). В такой среде разливается по ампулам, высушиваются мезофильно (-400С), ампулы запаивают. Наклеивается этикетка с указанием названия препарата, № партии, количество активных клеток в препарате, завод изготовитель, срок годности.
Для каждой партии проводится контроль качества: бактериальная чистота препарата (определяемой содержание сапротрофов должно быть не более 300 клеток на заданный объем препарата, должны отсутствовать патогенные и условно патогенные м/о). оценивается безвредность препарат, бактериальная активность препарата (жизнеспособность и активность кислотообразования).
Кроме пробиотиков для стимуляции роста нормофлоры используются пребиотики – пищевые добавки, которые стимулируют рост нормофлоры. Это природные или синтетические низкомолекулярные углеводы, которые не гидролизуются ферментами ЖКТ (т. е. до толстого кишечника доходят в неизменном виде).
Синтетические – лактулоза (лактоза + фруктоза). Она стимулирует рост бифидо- и лактобактерий. - парааминобензойная кислота, Са соль пантотеновой кислоты.
Природные – инулин – полимер фруктозы, в достаточно высокой концентрации содержится в одуванчиках, георгине.
Комплексные – симбиотики – смесь пробиотиков и пребиотиков.
Основы инженерной энзимологии.
ИЭ – использование иммобилизированных клеток и ферментов (закрепленных).
Основная задача – это разработка биотехнологических процессов в которых используются каталитически действующие ферменты, выделяемые из биологических систем или находящиеся внутри клеток, лишенных способности к росту.
Эффективность разработок по ИЭ определяется:
Выбором объекта;
Выбором носителя для иммобилизации;
Способом связывания объекта и носителя.
Преимущества использования иммобилизированных объектов:
Удержание объекта в объеме реактора;
Высокая активность процесса;
Возможность контроля за м/о объекта;
Возможность быстрого и полного отделения биотехнологического продукта;
Возможность организации непрерывного процесса с многократным использованием биологического объекта.
Иммобилизированные клетки и ферменты используются для:
Получение органических кислот и аминокислот;
Получение глюкозо-фруктозных сиропов;
Биологическая трансформация в-в;
Использование в качестве биосенсоров – это устройства в которых чувствительный слой содержит биологический материал, реагирующий на присутствие определенного компонента и генерирующие электрический сигнал, связанный с концентрацией и наличием этого в-ва. Биологическим материалом м. б ферменты, ткани, бактериальные клетки, антиген, антитела, отдельные органеллы клеток, рецепторы организмов ДНК. 1-е биосенсорное устройство – глюкометр, 2-е – использование иммобилизированного фермента уреазы в аппарате искусственная почка. Иммобилизированные клетки часто явл. тромболитическими ферментами.
Иммобилизированные клетки используются для осуществления процессов биотрансформации или биосинтеза. На протяжении нескольких месяцев или лет. Первый опыт был проведен более 100 лет назад – это было получение уксуса бактериями, иммобилизированными на буковой стружке. Наиболее активно в 70-е гг. ХХ в. Иммобилизированными м. б. м/о различных таксономических гр., животных клеток, споры частично поврежденных клеток (замороженные/оттаявшие), мертвые клетки (ацетоновые тела).
Иммобилизированные клетки имеют ряд преимуществ перед свободноживущими или иммобилизированными ферментами:
Отсутствие затрат на выделение ферментов;
Отсутствие или снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;
В клетках наблюдается более высокая ферментативная активность и более высокая стабильность ферментов;
Отмечается возможность создания полунепрерывных и непрерывных автоматизированных процессов;
В клетках м. б. длительная регенерация Ко-фактора (восстановление НАД•Н2, НАДФ•Н2).
