Культивирование биотехнологических объектов.

На этом этапе биотехнология наиболее тесно пользуется экономическими характеристиками. Различные процессы – брожения, биоконверсии, биотрансформации и др. но чаще др. используется термин биосинтез (получение первичных и вторичных метаболитов клеточной биомассы), процесс биотрансформации (ферментация различных продуктов, компостирование, детоксификации токсинов, выщелачивание руд).

Особенности применения.

1. Процесс культивирования реализуется в условиях строгой чистоты культуры, что достигается использованием стерильных питательных сред, основного и дополнительного оборудования.

2. Для КБО используются сложные многокомпонентные среды, при этом многие свойства используемых сред могут меняться в процессе культивирования – кислотность, вязкость и др.

3. Большинство процессов культивирования осуществляются при умеренных t и значениях рН близких к нейтральной.

4. При КБО наблюдается сложная биохимическая регуляция процесса роста культуры и накопления конечного продукта. При этом конечные продукты реакции могут влиять на скорость роста.

5. Скорость роста протекания биохимических процессов при КБО низкая, образующиеся продукты накапливаются в невысоких концентрациях и при этом не явл. товарными формами.

Одной из существенных особенностей КБО явл. подготовка питательной среды (компонентный состав). Питательные среды должны обеспечивать стабильность физико-химических условий выращивания и должны обеспечивать КБО питательными в-ми.

Из всех компонентов питательной среды отдельно выделяют углерод и энергию, как гл. компонент питательной среды. Остальные – как вспомогательные. Неотъемлемой частью питательной среды явл. вода – она обеспечивает протекание всех метаболических процессов и транспорт питательных в-в в клетку.

Питательные в-ва в среде м. б. в растворенной фазе (сахара, аминокислоты), образовывать коллоидные растворы (белки), твердое состояние (частицы S).

Существует несколько способов по фазовому состоянию фермента:

• Жидкофазная ферментация.

• Твердофазная ферментация (на поверхности в той или иной степени увлажненного субстрата).

Из сред натурального состава используются: злаковая среда, молочная сыворотка, низшие спирты, парафины нефти.

Синтетические смеси: 1 – гр. А – все биогенные элементы, кроме N;

2 гр. В – источник N;

3 гр. С – хелатирующие соединения;

4 гр. Д – определяющие буферные свойства среды.

Доброкачественность используемого сырья – это показатель, который определяет степень влияния вредных примесей на процесс выращивания биологического объекта или выход целевого продукта.

КБО проводится в специальных аппаратах, которые получили название ферментеры или биореакторы. Существует несколько различных типов ферментеров:

• Лабораторные;

• Пилотные (полупромышленные);

• Промышленные.

Лабораторные – V= 0,5-100 л – в них отрабатывают следующие параметры КБО:

• Скорость утилизации субстрата;

• Скорость роста культуры;

• Коэффициенты реакции;

• Определения накопления побочных продуктов.

Такие лабораторные ферментеры по техническим характеристикам отличаются от промышленных.

Пилотные – учитываются конструкторские детали промышленных, и те закономерности протекания биохимических реакций, которые были получены в лабораторных условиях.

Промышленные – V до 1000 м³. Разрабатываются согласно схемам промышленного производства, но вводятся коррективы и дополнения: охлаждение ферментеров (внешнее (рубашка) и внутреннее (змеевики)).

Процесс поэтапного увеличения объема и перехода от одной установки к др. называется – масштабированием.

Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы (ферментеры).Они представляют собой герметические котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную t, оптимальное значение рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных в-в. кроме того они снабжены системами перемешивания, аэрирования, охлаждения, пеногашения.

Основные конструкторские детали ферментеров (системы аэрации, перемешивания, пеногашения, охлаждения, стерилизации)

Существуют 2 типа КБО:

Периодическое – в культивируемую среду 1 раз вносится питательная среда и посевной материал. При таком типе популяция любых клеток проходит несколько стадий.

N 1 - лаг-фаза;

3

2 4

2 – экспоненциальная фаза;

3 – стационарная фаза;

1

4 – фаза отмирания

Log N – логарифм качества жизнеспособных клеток бактерий.

T

Лаг-фаза (фаза задержанного роста) – промежуток времени м/у инокуляцией бактерий и достижением ими мах. скорости деления. В клетках бактерий в этот период идет приспособление к условиям культивирования (состав среды, t, рН и др.).

Продолжительность фазы зависит от:

1. Начальных условий культивирования вносимого посевного материала. Если источники энергии и С в новой среде отличаются от тех, которые были до этого, то для приспособления к новым условиям в клетках должен быть синтезирован набор ферментов, потребности в которых раньше не было. Этот процесс индуцируется внесением нового субстрата. Во время лаг-фазы в химическом составе бактериальной клетки наблюдается быстрое увеличение количества РНК (8-12 раз).

2. Возраста посевного материала. Чем старше культура, тем длиннее лаг-фаза. Но при значительном количестве засеваемого активно делящегося посевного материала культура может развиваться и без лаг-фазы.

Во время лаг-фазы клетки не делятся, а только готовятся к размножению.

Фаза экспоненциального (логарифмического роста) – наблюдается постоянная мах. скорость деления клеток и скорость роста. величины зависят от вида бактерий. Во время экспоненциальной фазы все клетки в популяции имеют приблизительно одинаковый размер, содержат мах. количество РНК и белка. В это время клетки наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью.

Стационарная фаза – число жизнеспособных клеток достигает мах., оно не увеличивается, т. к. скорость размножения равна скорости отмирания. Т. к. скорость роста определяется концентрацией субстрата, то еще до полного его использования скорость роста начинает постепенно снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста снижается также при высокой плотности бактериальной популяции, низком парциальном давлении О₂, накоплении токсических продуктов обмена. Все это приводит к переходу в стационарную фазу.

Стационарная фаза характеризуется:

• Периодом несбалансированного роста – компоненты клеток синтезируются с различными скоростями, соответственно и содержание отдельных химических в-в в клетках на разных стадиях отличается.

• Химический состав клеток зависит от фактора, лимитирующего рост.

• Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к различным воздействиям (физико-химическим), чем в экспоненциальной фазе.

• В этот период могут накапливаться продукты вторичного метаболизма: антибиотики, пигменты, бактериоцины и др.).

Продолжительность фазы от нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от вида м/о.

В стационарную фазу поведение клеток в бактериальной популяции может регулироваться апоптозом. Суть сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция бактерий разделяется на 2 субпопуляции, одна из которой погибает и подвергается автолизу. Др. популяция использует продукты автолиза как субстрат и продолжает размножаться.

Фаза отмирания – экспоненциально снижается число живых клеток. Скорость отмирания бактерий варьирует в зависимости от условий среды и физиологических особенностей организма. Причины отмирания м. б. разными: накопление органических кислот, автолиз, накопление антибиотиков, бактериоцинов и др.

Целевые продукты при КБО по способу образования м. б. разделены на 3 типа:

1. Продукты образующиеся в результате реакций первичного энергетического метаболизма. М/у потреблением субстрата и образование продукта существует прямая зависимость S → P (клеточная биомасса). Некоторые первичные метаболиты (аминокислоты, витамины) образуются в такой же зависимости.

N удельная скорость роста μ

Время генерации q

S

T

2. Продукты, образующиеся в результате побочных реакций первичного энергетического обмена.

S → A → B → D

↓

C→ конечный продукт.

3. Вторичные метаболиты – образуются на завершающих стадиях роста культуры, конец стационарной фазы и фаза отмирания. В это время в клетке накопилось достаточное количество в-в для этого.

Разновидности – отъемно-доливное культивирование – из ферментера может удаляться ок 25% от объема культуральной жидкости, а такое же количество среды добавляется.

Непрерывное (проточное) – в ферментер постоянно вносится определенное количество свежей среды и удаляется часть среды с клетками м/о. это позволяет длительное время задерживать культуру в состоянии экспоненциального роста.

Такой тип культивирования имеет 2 разновидности.

А. непрерывное вытеснение – ферментер – труба, в которую подается исходный субстрат и посевной материал. Смесь продвигается по ферментеру. На выходе количество клеток зависит от количества субстрата. Перемешивания и аэрирования в них нет. Они используются в анаэробных процессах или в процессах сопровождаемых недостатком О₂. Кривая роста клеток реализуется не во времени, а в пространстве. Этот процесс используется в биофильтрах.

Б. полное смешение – скорость разбавления (Д) – отношение притока среды в единицу времени к общему объему среды в ферментере. Этот процесс идет в аппаратах 2 типов.

Хемостат. Состоит из сосуда-культиватора, в который с постоянной заданной скоростью поступает питательная среда. Для равномерного и полного смешивания питательных в-в содержимое ферментера механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Избыточная биомасса клеток с питательной средой вытекает из культиватора ч/з сливной сифон. В хемостате прирост биомассы пропорционален скорости притока субстрата и удаления продуктов метаболизма. Примером хемостата в природе служит рубец жвачных животных.

Турбидостат. Ферментер, в котором поддерживается заданная плотность клеток за счет определения оптической плотности среды культивирования. Когда количество биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, что фиксируется фотоэлементом, соединенным с системой реле, включается подача свежей питательной среды.