- •Классификация продуктов биотехнологии.
- •Получение накопительной культуры.
- •Выделение чистой культуры.
- •Рассев шпателем (метод Коха):
- •Рассев петлей (метод истощающего штриха):
- •Определение чистоты выделенной культуры.
- •Основными объектами биотехнологии являются м/о т. К.:
- •Виды микроорганизмов используемые в биотехнологии.
- •Подходы к генетическому изменению объектов биотехнологии, in vivo.
- •Отбор случайных мутаций.
- •Отбор среди мутантов с определенным фенотипом.
- •Создание биологических штаммов in vitro.
- •1972 Г. – начаты исследования по ги в лаборатории Берга. Получена первая рекомбинантная днк, которая представляла собой фрагмент вируса sv 40, фрагмент e. Coli, фрагмент оперона.
- •Инструментами ги являются:
- •Методы выделения генов.
- •Выделение генов из природных (нативных) днк.
- •Синтез гена на м-рнк, как матрице (получение комплемента (к- днк).
- •Классификация векторных молекул для бактериальных клеток в зависимости от цели клонирования.
- •Клонирование в клетках Bacillus subtilis.
- •Искусственная бактериальная хромосома.
- •В молекуле на основе фаговых днк м. Б. Получены на основании 1-нитевых фагов. Это м 13, fd, f1 и др.
- •Векторы для клонирования в клетках животных.
- •Векторы для клонирования высших растений.
- •Способы введения рекомбинантных днк в клетку.
- •Культивирование биотехнологических объектов.
- •Преимущества непрерывного культивирования:
- •Твердофазная ферментация (тфф).
- •Получение белка одноклеточных организмов (боо).
- •Кормовые дрожжи.
- •В настоящее время пробиотики как биотехнологический продукт делятся на несколько типов:
- •Основы инженерной энзимологии.
- •Иммобилизированные ферменты:
- •Клеточная инженерия
- •Культуры каллусных клеток
- •Получение протопластов
- •Культивирование протопластов
- •Слияние протопластов
- •Гибридизация соматических клеток
- •Культивирование животных клеток
- •Культуральные системы животных клеток
- •50 Пересевов, которые затем трансформируются в постоянные (переви-
- •Первичные культуры
- •0,25 % Трипсин, 200−2000 ед./мл коллагеназа) дезагрегации. В случае
- •Постоянные культуры
- •1,5−3 Раза), по снижению зависимости от сыворотки и возможности под-
- •Типы культуральных систем
- •Монослойные культуры
- •Суспензионные культуры
- •0,01 % Эдта с последующим длительным периодом адаптации, сопро-57
- •Монослойное культивирование на микроносителях
- •Питательные среды
- •Клеточный цикл и цикл роста
- •24 Часа. При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно
- •Синхронизация клеток
Способы введения рекомбинантных днк в клетку.
Рекомбинантные ДНК вводятся в клетки – реципиенты. В генной инженерии такие реципиентные клетки играют 2 роли. 1. Они позволяют отыскивать в банке генов клоны синтезируемой рекомбинантной ДНК. 2 Впоследствии такие реципиентные клетки могут использоваться для получения целевых продуктов.
Способ введения рекомбинантной ДНК учитывается на основе вектора какого типа была получена такая рекомбинантная ДНК и в клетки каких организмов необходимо ее ввести путем трансформации клетки или протопласта, или с использованием метода электропорации. Если рекомбинантную ДНК получать на основании фагов, ее можно вводить в изолированную ДНК – это трансвекция. Можно вводить интактные фаговые частицы – это инфекция (космиды, фазмиды).
Др. способы генетического обмена – конъюгация, трансдукция.
В клетках растений – трансформация растительных протопластов, обработка растительных клеток или тканей рекомбинантыми ДНК; широко используются инъекции рекомбинантных ДНК в ядро; использование липосом. Липосомы – сферические структуры, которые имеют липидную оболочку, внутри которой находится рекомбинантная ДНК. Для введения в клетки животных – вирусные инфекции, метод электропорации, микроинъекции в ядро. Если после введения рекомбинантной ДНК все клетки в организме ее наследуют, то говорят о получении трансгенного организма.
Электропорация – клетки или протопласт в течение короткого промежутка времени подвергаются воздействию тока высокого напряжения (2000-4000 вольт). В результате в мембране клетки образуются поры ок. 30 нм, которые могут существовать 1-2 минуты и ч/з которые в клетку могут поступать рекомбинантные ДНК. Затем поры закрываются, а ДНК остается в клетке. Это универсальный способ.
Баллистический метод – применятся преимущественно у эукариот. Используются баллистические пушки в которые вносятся частицы АК или W, на которые напыляются рекомбинантная ДНК. Затем, с помощью инертных газов при ↑Р, такие частицы выстреливаются из пушки в культуру клеток. По различным закономерностям часть частиц попадает в ядро и рекомбинантные ДНК там задерживаются.
Поиск клонов с рекомбинантной ДНК.
Этот этап сложен и непредсказуем.
Самый простой метод – это поиск клонов по фенотипу после введения рекомбинантной ДНК (например пигментация). Можно воспользоваться комплементационными тестами, но необходимо иметь мутантные клетки, дефективные по синтезу активного продукта.
Методы гибридизационные – необходимо наличие специфических меченых ДНК или РНК зондов. Чаще их метят Р32. Зондами м. б. короткие олигонуклеотидные последовательности, которые соответствуют наиболее консервативной части отыскиваемого гена. Эти консервативные последовательности могут включать до 100 нуклеотидов для прокариот и до 1000 для эукариот.
После введения рекомбинантной ДНК, формирующиеся на среде колонии, переносятся на специальный нитроцеллюлозный фильтр. Их подвергают лизису и последующей денатурации ДНК с использованием щелочи. ДНК прочно связывается с фильтром. Фильтр промывается и обрабатывается радиоактивным меченым зондом и определяют тот клон с которым этот зонд связался.
Иммунохимические методы – клоны после введения рекомбинантной ДНК лизируют и обрабатывают антителами к соответствующему продукту. Такие антитела – меченые.