Векторы для клонирования в клетках животных.

SV 40 – обезьяний вирус – содержит 2-нитевую ДНК размером 5 тыс. пар оснований. Он может с различным результатом размещаться в клетках макак резус и в клетках грызунов. При заражении обезьян данный вирус проходит литический цикл развития, т. е., после проникновения в цитоплазму клетки, происходит раздваивание вируса. ДНК попадает в ядро клетки, где начинается транскрипция ранних, а затем и поздних генов.

Ранние гены обеспечивают образование вирусных НК и обозначаются как T, t-антиген.

Поздние гены – обеспечивают образование 3 белков вирусного капсида VP 1, VP 2, VP 3.

В результате происходит образование зрелых вирусных частиц, ч/з 30 мин – лизис инфицированной клетки. Клетки, в которых происходит литический цикл развития – клетки пермиссивные.

Если SV 40 попадает в организм грызуна, он встраивается в одну из хромосом и развивается. Наблюдается неупластическая трансформация – непермиссивные.

Необходимо наличие точки начала репликации, наличие регуляторной последовательности, для начала транскрипции и-РНК.

Суммарные размеры рекомбинантной ДНК не должны быть более 5 тыс. пар оснований.

Либо в составе рекомбинантной ДНК, либо в составе генома клетки д. б. гены, которые обеспечивают образование белков малого и большого антигена, а также белков вирусного капсида.

В настоящее время существует 3 вектора на основе SV 40.

1. Векторы трансдуцирующие – рекомбинантные ДНК вводятся в пермиссивные клетки, которые образуют вирусные частицы.

2. Векторы плазмидные - рекомбинантные ДНК вводятся в непермиссивные клетки, в которые она за определенное время либо встраивается, либо наследуется как плазмида.

3. Векторы пассивные (трансформирующие векторы) – служат для введения ДНК в клетки, обеспечивая ее встраивание в хромосому, но сам вектор в клетке не наследуется.

С учетом этих подходов можно использовать 2 приема для введения рекомбинационной ДНК в клетку. В составе вирусной ДНК на чужеродном фрагменте можно заменить либо ранние области генома, либо поздние. В случае, если идет замещение поздней области генома, необходимо использовать вирусы-помощники, прошедшие постртрасвекции или заражение 2 типовыми вирусными частицами, которые различаются дефектам в ранней или поздней области гена. Образуется потомство с частицами без рекомбинантных ДНК и с частицами вируса-помощника.

Замещение ранней области генома – используются специальные клеточные линии (cos линии клеток) в которой содержатся гены связанные с образованием малого и большого Т-антигена и при попадании в такие клетки рекомбинантных ДНК инициируется репликация такой ДНК, синтезируются белки вирусной оболочки и образуются вирусные частицы, все из которых содержат рекомбинационные ДНК.

Также можно использовать ретровирусы, осповакцины, папиломовирусы, аденовирусы. Для клонирования в клетке-носителе - бакуловирусы.

Векторы для клонирования высших растений.

Сегодня используется 1 вектор. Он построен на основе Ti-плазмиды. Она содержится у бактерий Agrobacterium tumefacies при инфицировании корней двудольных растений (виноград, олива, роза) может вызывать образование корончатых галлов (опухолей). Другие векторы – ДНК некоторых вирусов, хлоропласты и митохондрии ДНК – в теории.

Векторы на основе Ti-плазмиды были предложены в 1980 г. Ti-плазмиды крупные, различаются от 200 и более тыс. пар оснований, и выделением в ее составе 4 функциональных групп генов.

1. Tra – гены отвечающие за передачу Ti-плазмиды м/у клетками.

2. Rep – гены связанные с репликацией.

3. Vir – отдельно; гены вирулентности – их продукты отвечают за образование опухоли, т. е. они стимулируют синтез ИУК (индолилуксусная кислота).

4. Ок. 10% тела Ti-плазмиды – Т-ДНК - этот фрагмент способен передаваться растительной клетке и случайным образом встраиваться в одну из хромосом. Важным для вырезывания Ti-плазмид явл. наличие на концах Т-ДНК коротких последовательностей размером 25 пар оснований. За счет активности продуктов vir генов в пределах этих последовательностей происходит вырезание Т-ДНК и перенос ее в растительную клетку. Исходя из этого были сконструированы 2 типа векторов используемые для клонирования в растительных клетках.

Общим подходом для конструирования в этих векторах – клонированный фрагмент или чужеродная ДНК вводится в векторную молекулу (чаще E. Coli), затем такая рекомбинантная ДНК переносится в клетку агробактерий и уже из них она м. б. введена в растительную клетку.

1 тип векторов – о-интегративные – для их получения в клетке E. Coli конструируется промежуточный вектор. Это плазмида в составе которой есть чужеродна ДНК, селективный маркер, область гомологии с фагом Т-ДНК. Такая конструкция вводится в клетку агробактерии, в клетке агробактерии есть рецепторы Ti-плазмиды в составе которой есть vir гены, обладающие гомологией с Т-ДНК, которая ограничена последовательностью 25 пар оснований. В клетках агробактерий, в результате рекомбинации по области гомологии образуется интегративный вектор, в который входит и клонированная ДНК, в которую входит последовательность из 25 пар оснований и vir гены. Т. е., есть все возможности, чтобы последовательность, ограниченная 25 парами оснований была вырезана и передана растению.

2 тип векторов – бинарные векторы – здесь также используются 2 типа плазмид. В клетках агробактерий получена хелперная плазмида, которая создает гены вирулентности. В клетках E. coli получают бинарный вектор, который соединяет чужеродную ДНК, ограниченную 25 парами оснований. При совмещении этих плазмид в векторах бактерий продукт в транс- положении способен вырезать чужеродную ДНК и переносить ее в клетки агробактерий.