- •Классификация продуктов биотехнологии.
- •Получение накопительной культуры.
- •Выделение чистой культуры.
- •Рассев шпателем (метод Коха):
- •Рассев петлей (метод истощающего штриха):
- •Определение чистоты выделенной культуры.
- •Основными объектами биотехнологии являются м/о т. К.:
- •Виды микроорганизмов используемые в биотехнологии.
- •Подходы к генетическому изменению объектов биотехнологии, in vivo.
- •Отбор случайных мутаций.
- •Отбор среди мутантов с определенным фенотипом.
- •Создание биологических штаммов in vitro.
- •1972 Г. – начаты исследования по ги в лаборатории Берга. Получена первая рекомбинантная днк, которая представляла собой фрагмент вируса sv 40, фрагмент e. Coli, фрагмент оперона.
- •Инструментами ги являются:
- •Методы выделения генов.
- •Выделение генов из природных (нативных) днк.
- •Синтез гена на м-рнк, как матрице (получение комплемента (к- днк).
- •Классификация векторных молекул для бактериальных клеток в зависимости от цели клонирования.
- •Клонирование в клетках Bacillus subtilis.
- •Искусственная бактериальная хромосома.
- •В молекуле на основе фаговых днк м. Б. Получены на основании 1-нитевых фагов. Это м 13, fd, f1 и др.
- •Векторы для клонирования в клетках животных.
- •Векторы для клонирования высших растений.
- •Способы введения рекомбинантных днк в клетку.
- •Культивирование биотехнологических объектов.
- •Преимущества непрерывного культивирования:
- •Твердофазная ферментация (тфф).
- •Получение белка одноклеточных организмов (боо).
- •Кормовые дрожжи.
- •В настоящее время пробиотики как биотехнологический продукт делятся на несколько типов:
- •Основы инженерной энзимологии.
- •Иммобилизированные ферменты:
- •Клеточная инженерия
- •Культуры каллусных клеток
- •Получение протопластов
- •Культивирование протопластов
- •Слияние протопластов
- •Гибридизация соматических клеток
- •Культивирование животных клеток
- •Культуральные системы животных клеток
- •50 Пересевов, которые затем трансформируются в постоянные (переви-
- •Первичные культуры
- •0,25 % Трипсин, 200−2000 ед./мл коллагеназа) дезагрегации. В случае
- •Постоянные культуры
- •1,5−3 Раза), по снижению зависимости от сыворотки и возможности под-
- •Типы культуральных систем
- •Монослойные культуры
- •Суспензионные культуры
- •0,01 % Эдта с последующим длительным периодом адаптации, сопро-57
- •Монослойное культивирование на микроносителях
- •Питательные среды
- •Клеточный цикл и цикл роста
- •24 Часа. При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно
- •Синхронизация клеток
В молекуле на основе фаговых днк м. Б. Получены на основании 1-нитевых фагов. Это м 13, fd, f1 и др.
М 13 содержит в своем составе 1-нитевую ДНК, при клонировании в составе таких фагов учитывается следующее:
В составе ДНК есть некодирующие последовательности, внутрь которых можно проводить встаривание чужеродной ДНК;
Клонировать можно фрагменты ок. 5 тыс. пар оснований;
После заражения клетки они не вызывают их лизиса, а способны секретироваться из клетки, накапливаться в среде и, следовательно, можно получать фаговые лизаты с высоким титром;
После клонирования in vitro фрагмент 2-нитчатой формы водится в клеточный цикл фага завершается и образуются 1-нитчатые ДНК содержащие клонированный 1-нитевой фрагмент.
Использование 1-нитевых фагов:
Используются для осуществления процесса секвенирования (определение нуклеотидной последовательности);
Используются для направленного мутагенеза;
Используются для приготовления радиоактивных зондов.
Принципы клонирования в клетках дрожжей.
Дрожжи возбудители многих типов брожения, при этом в качестве субстрата используется широкий набор различных углеводов. Дрожжи – самые хорошо изученные представители эукариот. Они имеют геном в 3 раза больше, чем у E. coli, состоящий из 17 хромосом. Дрожи обеспечивают экспрессию и транскрипцию всех эукариотических генов.
Дрожжи быстро растут, легко культивируются, время их удвоения ок. 1,5 часа.
Для дрожжей выделены и охарактеризованы собственные плазмиды 2μ (2-микронная плазмида).
Дрожжи во многих странах признаны генетически безопасными организмами, т. е. их можно использовать для получения продуктов медицинского назначения.
При конструировании векторов для клеток дрожжей максимально используются возможные бактериальные плазмиды и собственные плазмиды дрожжевых клеток. В соответствии с этим описано 5 различных типов векторов для клонирования в клетках дрожжей:
Тип 1 – интегрирующиеся – они созданы на основе бактериальных плазмид в состав которых включены отдельные гены хромосом дрожжей. Как правило, это гены которые связаны с синтезом определенных внутриклеточных продуктов (витамины, аминокислоты и др.). тип того или иного гена определяется в комплементационном тесте (т. е. используются соответствующие мутанты не способные к выработке продукта).
Тип 2 – реплицирующиеся – получаются на основе 2μ плазмиды и имеют в своем составе помимо клонируемых генов ars-последовательности хромосом дрожжей. Это последовательности, которые обеспечивают репликацию хромосом. Они могут самореплицироваться в клетках дрожжей, но они характеризуются высокой степенью митотической нестабильности.
Тип 3 – эписомальные – содержат репликативные последовательности 2μ плазмид, репликативные последовательности бактериальных плазмид, селективные маркеры бактериальных плазмид. Это челночные векторы, которые могут наследоваться в клетках дрожжей, и в бактериальных клетках. Но они нестабильны при снятии селективного давления.
Тип 4 – центромерные (кольцевые линии хромосом), содержат ars-последовательности хромосом + CEN-последовательности (центромерные участки хромосом дрожжей) + 2μ плазмида.
Но они содержаться в 1 или 2 копиях.
Тип 5 теломерные (линейные минихромосомы). В составе таких векторов содержаться теломерные участки хромом эукариот, которые обеспечивают отсутствие чувствительности к эндомерным нуклеотидам. По сути – искусственные хромосомы дрожжей.