10. Генетического конструирования микроорганизмов: мутагенез и методы выделения мутантов.

В живой клетке одновременно синтезируется множество соединений.Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма.

Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями:

1) путем спонтанного изменения генетической природы организма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы;

2) путем индуцированного мутагенеза. Метод основан на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (таких как, азотистая и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лучей.

Генетическое конструирование in vivo включает получение и выделение мутантов, и использование различных способов обмена наследственной информацией живых микробных клеток. Важнейшим методом селекции м/о является отбор мутантов, т. е. организмов с измененными наследственными признаками, которые появляются в результате мутаций. Различают мутации:

1.Цитоплазматические – затрагивающие внехромосомные генетические детерминанты, с материалом у эукариот – в митохондриях, у прокариот – в плазмидах;

2 Ядерные или хромосомные – затрагивают изменение числа хромосом. Ядерные делятся на 3 типа:

1 – изменение числа хромосом; 2 – изменение числа и порядка расположения генов (структурные мутации); 3 – внутригенные мутации.

В селекции м/о основное значение имеют 2 последних типа. Структурные мутации:

1 делеции – выпадение участков хром;

2 дупликации – удвоение генов;

3 амплификации – умножение числа отдельных генов или групп генов; 4 транслокации – обмен участками между хромосомами;

5 транспозиции – вставка участка хром. в новые места;

6 инверсии – изменение порядка расположения генов на хромосоме. Внутригенные мутации (изменяют последовательность оснований ДНК в пределах одного гена):

1 транзиции – замена 1 основания;

2 трансверсии - замена пуриновых оснований;( в клетках такого типа мутанта синтезируется неактивный белок с измененной последовательностью аминокислот);

3 реверсия – возвращение к дикому типу(в ДНК восстанавливается исходная последовательность оснований).

Реверанты – мутанты, вернувшиеся к дикому типу могут быть спонтанными, индуцированными. Спонтанные, неконтролируемые мутации возникают с низкой частотой Для обнаружения спонтанных мутаций используют селективные среды, индикаторные (когда невозможно провести прямой отбор мутантов) среды. Так изучают морфологию клеток, сдвиг рамки считывания. В качестве тест – культур используют ауксотрофы, дающие рост в том случае, если мутанты выделяют в среду искомый метаболит, а так же чувствительные культуры, рост которых подавляется, если мутант продуцирует антибиотик. В этом случае по зоне роста или зоне ингибирования роста тест – культуры можно говорить о продуктивности мутанта.

Получение ауксотрофных мутантов с помощью метода отпечатков может быть облегчено, если обогащать ими популяцию клеток, используя пенициллин или его аналоги. Эти антибиотики убивают только растущие клетки. Ауксотрофы дают высокий выход продукта. Для повышения частоты мутаций м/о подвергаются физиологическому воздействию ультрафиолетовые волн (индуцированный мутагенез). Применение мутагенов (УФ) повышает частоту мутаций в 100- 1000 раз. Для E. Coli выделение пролина в среду в том