III. Химический состав микобактерий
Микробная клетка на 86% состоит из воды, 14% распределены между белками, углеводами, липидами, минералами, солями. Высокое содержание воды способствует устойчивости и сохранению жизнеспособности возбудителя во внешней среде.
Липиды составляют от 10 до 40% сухого вещества. Разные виды микобактерий туберкулеза содержат разное количество л ипидов (тусоЬас1епит ШЬегси1оз18 - 16%, тусоЬас 1'епит ьоу/'з - 11%). Содержание липидов меняется с возрастом культуры: молодые особи содержат меньшее количество липидов по сравнению со старыми. Липиды растворимы в спирте, эфире и хлороформе.
Установлены три фракции липидов (жиров):
1 . Жиры, растворимые в ацетоне и эфире.
Фракции жиров, не растворимые в ацетоне - фосфатидные, растворимые в эфире - жировые.
Жиры, растворимые в хлороформе, не растворимые в эфире, алкоголе, ацетоне, метиловом спирте - восковые.
Наиболее активная из этих фракций – фосфатидная. С ней связано развитие в инфицированном организме эпителиоидных и гигантских многоядерных клеток Лангханса. Введение фосфатидов внутрикожно или подкожно здоровым животным приводит к образованию эпителиоидно-клеточных узелков, которые могут постепенно регрессировать. При морфологическом исследовании можно видеть местную пролиферацию макрофа/ов, моноцитов, которые превращаются в эпите-лиоидные клетки и гигантские многоядерные клетки Лангханса. Фосфатиды находятся в твердом состоянии, имеют желтоватый цвет, В их состав входят насыщенные жирные кислоты, такие как пальмитиновая и стеариновая; ненасыщенные-олеиновая, линолеиновая, ли-нолиновая. Биологическая активность фосфатидов обусловлена присутствием в них фтиоидной кислоты.
Липидная фракция, полученная при экстракции вирулентных живых, молодых, поверхностно растущих культур петролейным эфиром имеет название корд-фактора (cord-жгут, веревка). Это вещество находится в клеточной стенке микобактерий туберкулеза в очень малых количествах: из 2 г микобактерий можно получить 1-2 мг корд-фактора. Считается, что корд-фактор приводит к склеиванию микобактерий туберкулеза в виде «кос» и «жгутов», и служит показателем их вирулентности и высокой токсичности.
С липидными фракциями связано такое свойство микобактерий туберкулеза, как кислотоустойчивость. Полностью обезжиренные микробные клетки свойство кислотоустойчивости не проявляют, Кислотоустойчивость липидных фракций обусловливается миколовой кислотой, входящей в состав восков микобактерий туберкулеза.
Белковый компонент – туберкулопротеины, составляют 56% сухого вещества клетки. С туберкулопротеинами связаны антигенные свойства микобактерий. Протеины микобактерий туберкулеза отличаются рядом антигенных свойств. При фракционировании туберкуло-протеина алкоголем при низких температурах и различных рН выявляются три типатуберкулопротеина (А.В.С.), которые различаются физико-химическими свойствами: растворимостью, осаждаемостью при ультрацентрифугировании и подвижностью при электрофорезе.
Протеин А бесцветен, обладает небольшой подвижностью при электрофорезе, высоко растворим и наиболее биологически активен. Он состоит из молекул крупной величины (молекулярный вес – 32.000-44.000).
Протеин В менее растворим, чем протеин А, более подвижен при электрофорезе, молекулярный вес равен 16.000, в биологическом отношении менее активен.
Протеин С не растворим при рН-4,0, имеет окраску, состоит из молекул наименьшей величины (молекулярный вес – 9.000), обладает наибольшей подвижностью при электрофорезе, тесно связан с нуклеиновой кислотой, образует комплексы - нуклеопротеиды, обладает наименьшей активностью, не имеет антигенных свойств.
Туберкулопротеины А, В, С являются сложными белками, состоящими почти из всех известных аминокислот, но 65,5% составляет гуанин и цитозин.
Все туберкулопротеины обладают первичной токсичностью: в дозе 100-150 мг они могут убить здоровое животное в течение 48 часов. Кроме того, в разной степени им присущи и антигенные свойства. Они реагируют т Уйго с антителами, имеющимися в плазме людей и животных, больных туберкулезом. При повторном введении нормальным животным туберкулопротеины А и В могут вызвать реакции анафилактического типа. В результате сенсибилизации в дозе 10-15-30 мг у морских свинок в ответ на повторное введение развивается анафилактический шок, убивающий животных в течение нескольких минут. Сенсибилизация, вызванная туберкулопротеином, может передаваться пассивно. Туберкулопротеины могут играть роль разрешающего фактора у животных, больных туберкулезом: при введении в инфицированный организм они вызывают местные и общие реакции замедленного типа. Так как из всех фракций микобактерий только протеины являются разрешающим фактором для выявления сенсибилизации в инфицированном организме, то, видимо, они и играют наибольшую роль в ее возникновении.
Полисахариды входят в состав микобактерий туберкулеза и находятся как в свободном, так и связанном состоянии с фосфатидами, восками и белками. Полисахариды можно выделить из фильтратов культур при длительном выращивании на синтетических средах.
Очищенные полисахариды возбудителя туберкулеза при введении здоровым животным не вызывают какой-либо реакции, они не обладают ни антигенными, ни сенсибилизирующими свойствами, но имеют признаки гаптенов и вызывают реакцию преципитации с сывороткой больных животных. Они проявляют высокую серологическую активность и могут вызывать реакцию преципитации при разведениях 1:2.000.000; 1:6.000.000.
Серологическая активность полисахаридов связана с присутствием в их молекуле пентозы. При введении в инфицированный человеческий организм полисахариды не вызывают местных реакций, подобных тем, которые вызывают туберкулопротеины. Но при внутривенном введении больным морским свинкам полисахарид способен вызвать острые симптомы анафилактического шока, нередко со смертельным исходом.
Минеральные вещества микобактерий составляют около 6% массы клеток. Это кальций, фосфор, магний, железо, цинк, сера, марганец. Минеральные вещества активизируют рост возбудителя туберкулеза.
Контрольные вопросы:
1 . Опишите химический состав возбудителя туберкулеза.
Определите роль туберкулопротеинов в реакциях организма на МВТ.
Обозначьте роль липидов, углеводов в реакции организма на возбудитель туберкулеза.
Ферментная активность. Все обменные процессы в микробной клетке осуществляются при помощи ферментов. Бактериальная клетка может самостоятельно производить все необходимые для своего обмена ферменты: аминотрансферазы, эстеразы, липазы, треголазы, уреазы и ферменты типа амилаз.
Благодаря ферментам эстеразе и липазе происходит процесс расщепления жиров, что дает возможность использовать их как питательный материал. Дегидразы расщепляют органические кислоты, в том числе и аминокислоты. Фермент уреаза способен расщеплять мочевину. У вирулентных штаммов этот процесс осуществляется в течение 10-12 часов.
В окислительно-восстановительных процессах, внутриклеточном дыхании микобактерий туберкулеза большое участие принимают ферменты оксидоредуктазы: дегидраза, оксидаза, а также каталаза и пе-роксидаза. С этими ферментами частично связаны такие свойства микобактерий туберкулеза, как вирулентность и лекарственная устойчивость к препаратам группы гидразида изоникотиновой кислоты. Завершающим продуктом окислительно-восстановительных процессов является перекись водорода. Каталаза расщепляет перекись водорода на воду и кислород: Н20.+каталаза->Н20+02. Пероксидаза катализирует окисление перекисью водорода некоторых фенолов и ароматических аминов.
Контрольные вопросы:
1. Перечислите основные ферменты, продуцируемые возбудителем туберкулеза и определите их роль в его жизнедеятельности. Витамины. Микобактерий туберкулеза способны сами синтезировать витамины, в которых нуждаются. Это дает им возможность расти на простейших («голодных») питательных средах, состоящих из синтетических веществ, лишенных витаминов, необходимых для их роста и жизнедеятельности.
Доказано, что микобактерий могут вырабатывать такие витамины, как биотин, фолиевую кислоту, тиамин, рибофлавин, пантотено-вую кислоту, пиридоксин, инозитол, никотиновую кислоту и другие. Установлено, что mycobacterium tuberculosis вырабатывают витамины в значительно большей степени, чем mycobacterium bovis. С этим связан их более быстрый и энергичный рост на питательных средах.
Размножение. Рост культуры возбудителя туберкулеза в обычных условиях в тканях организма и на питательных средах происходит в основном путем простого поперечного деления клетки
При электронно-микроскопическом исследовании выявлено, что деление начинается с двухстороннего вдавления цитоплазматической мембраны в цитоплазму. При соединении этих перегородок образуются дочерние особи.
Имеется и другой вид деления микробной клетки - почкование. Крупное гранулярное образование на полюсе клетки, окруженное небольшим участком цитоплазмы, продвигается к периферии клетки, образуя выпуклость на поверхности клеточной мембраны. В дальнейшем бугорок увеличивается и отпочковывается от материнской клетки в виде образования кокковидной формы.
Одним из возможных (но не доказанных) способов размножения микобактерий считается спорообразование. В цитоплазме клетки может происходить образование нескольких шаровидных структур, имеющих вид зерен, и медленное исчезновение цитоплазмы. Зерна освобождаются из клетки и могут прорастать в новые особи. Такой способ размножения роднит микобактерий с актиномицетами.
Микобактерий туберкулеза относятся к самому медленно растущему на искусственных средах микроорганизму. Цикл простого деления материнской клетки на две дочерние занимает 20-24 часа. Только высоковирулентные микобактерий туберкулеза могут делиться в сутки дважды.
Микроскопически видимый рост микроколоний на жидких средах можно обнаружить на 5-7 день, видимый рост колоний на поверхности твердой среды - в конце четвертой недели. С помощью молекуляр-но-биологических методов установлено, что причиной медленного роста микобактерий на искусственных средах являются большие расстояния между оперонами ггп и сайтами репликации ori С.
Оптимальный рост микобактерий туберкулеза осуществляется при рН среды 6,5 - 6,8, вместе с тем рост культуры возможен и при более кислой реакции (рН до 5,5) и при более щелочной (рН более 7,5), но он оказывается в этих условия менее оптимальным.
Дыхание. Все микобактерий являются «жадными» аэробами и для их роста необходимо определенное напряжение кислорода. Это объясняется тем, что у них почти полностью отсутствует анаэробный гликолиз. Но работами Л.М. Моделя (1952) доказана возможность их роста без доступа кислорода (глубинный рост под масляным слоем). Это дает основание относить микобактерий туберкулеза к факультативным анаэробам. Однако вопрос о факультативной анаэробное™ возбудителя туберкулеза является спорным.
Контрольные вопросы:
1 . Назовите основные витамины, продуцируемые возбудителем туберкулеза.
2. Каким образом осуществляется размножение возбудителя туберкулеза?