Әдістемелік нұсқаулар

Сарысу дайындау үшін көктамырдан 3-4 мл мөлшерде алынған қанды 10-15 минут 37°С-та термостатқа орналастырамыз. Қан ұйыған соң шыны түтікше қабырғасындағы қойыртпақтарды шыны таяқшамен ысылдырып, қойыртпақтың жақсы реакциясы мен сарысудың толық бөлектенуі үшін бір сағат бойы 4°С-та ұстайды. Сонан соң, сарысуды тамызғышпен абайлап ысылдырып алады.

1. Радиоиммунды әдіс. Зерттелуші үлгідегі спецификалық антиденелердің мөлшерін конкурентті байланысу варианттарын пайдалану арқылы анықтауға болады, мысалы, радиоактивті таңбаланған антиденелердің қатты фазада бекіндірілген спецификалы антигендермен байланысуын ингибирлеуге қабілеттілігі бойынша. Бірақ, көбінесе, иммуноглобулин молекуласының константалы аймағына спецификалы болып келетін радиоактивті таңбаланған антииммуноглобулинді антиденелердің көмегімен қатты фазада антигенмен байланысқан спецификалы антиденелерді айқындау әдісін қолданады. Бәрінен қарапайымдысы жануарлардың бір түрінің иммуноглобулиндерін екінші жануар түріне егу арқылы антииммуноглобулинді сарысу алу. Мұндай антииммуноглобулинді сарысу ұқсас түрлердің (тышқандардың, қояндардың және басқа түрлердің) кез-келген иммуноглобулиндерінің молекулаларын байланыстыра алады. Адам иммуноглобулиніне қарсы радионуклидтермен таңбаланған мұндай антииммуноглобулинді сарысуды РИА-де таңбаланбаған адам антиденелерінің бекіндірілген антигенде байланысуын айқындау үшін пайдаланады. Бұл антиммуноглобулинді сарысу антигендік эпитоптармен байланыса отырып, молекулалардың константалы бөліміндегі әртүрлі спецификалы антиденелерді "таниды".

РИА-ді немесе ИФА-ді пайдалана отырып, антигенспецификалы антиденелердің мөлшерін ғана емес, сол антиденелердің қандайда бір иммуноглобулин изотиптеріне тиесімділігін де анықтауға болады. Ол үшін иммуноглобулиндердің жекеленген изотиптері үшін спецификалы болып келетін антииммуноглобулинді антиденелер қолданылады. Мұндай антииммуноглобулинді антиденелерді бөліп алу жануарды нақты бір иммуноглобулиндер изотипінің тазартылған препаратымен иммунизациялаудан басталады. Алынған иммунды сарысудан көпмәртелік абсорбциялау жолымен басқа изотип иммуноглобулиндермен қиылыса әсерлесетін барлық антиденелерді шығарып тастайды. Алынған антиизотипті антиденелерді иммунды сарысудағы әрбір изотиптердің антигенмен әсерлесуші антиденелер санын анықтау үшін пайдаланады. Ерекше рольді IgE-ге қарсы антиденелер атқарады, олар анафилактикалық типті аллергиялық реакциялар мен атопиялық аурулардың зертханалық диагностикасында осы изотип иммуноглобулиндерінің және осы изотипке жататын спецификалық антиденелердің мөлшерін анықтауға мүмкіндік береді.

2. Иммуноферментті талдама. Антиденелерді айқындаудың едәуір сезімтал әдістерінің бірі ИФА деп есептеледі, ол сезімталдылығы бойынша РИА-ге жол бермейді және де қарапайым диагностикалық лабораториялар үшін арзанға түседі. Спецификалы антигенді полистирол (поливинилхлорид) пластиналарындағы ойықтар беткейіне адсорбциялайды. Пластиналарда бекіндірілген антигенді зерттелуші адами сарысумен инкубациялайды. Байланыспаған ақуызтардан шайып алған соң, иммобилизацияланған антигендермен байланысқан иммуноглобулиндерді пероксидаза ферментімен таңбаланған антитүрлік (антиадамдық) антииммуноглобулинді сарысу көмегімен анықтайды. Субстратпен (сутегі пероксиді) және индикатормен инкубациялаған соң боялу интенсивтілігі бойынша ферментативті активтілікті бағалайды. Антигенде сорбцияланған антиденелер санына пропорциянал болатын боялу интенсивтілігін көзбен немесе спектрофотометр көмегімен бағалауға болады. Бұл модификацияда таңбаланған реагент әмбебабтылығы ыңғайлы, ол әртүрлі антигендерге қарсы антиденелерді айқындауға мүмкіндік береді.

3. Иммуноэлектрофарез. Күрделі қоспалар құрамындағы жекеленген антигендер құрамаларына (мысалы, микроорганизмдердің жекеленген антигендеріне) қатысты спецификалы антиденелерді айқындау үшін қоаспалардан ақуызтарды бөліп алу әдістеріне жүгінуге тура келеді. Ақуызтарды бөліп алудың едәуір әйгілі әдістерінің бірі натрий доцицилсульфатының қатысуындағы полиакриламидті гельдегі электрофарез болып табылады. Оның қысқаша аты: SDS-PAGE. Гельдегі ақуызтар фракциясы олардың өлшеміне сәйкес таралады. Одан соң электрофорезді жазықтықта дараланған ақуызтарды нитроцеллюлаярлы пластинаға ауыстырады да, оларды сол жерде спецификалы антисарысумен өңдейді. Спецификалық антиденелер байланысатын ақуызтар жағдайы ферментпен немесе радионуклидпен таңбаланған антииммуноглобулинді антиденелер көмегімен айқындалады. Бұл әдіс Western blot (Бастыс дағы) деген атқа ие болды және қан сарысуындағы адам иммунотапшылықі вирусына қарсы антиденелерді айқындау кезіндегі нақтылаушы әдіс ретінде қолданылады. Ол үшін вирус ақуызтарын SDS-PAGE әдісі көмегімен бөлектейді, бөлектенген ақуызтарды нитроцеллюлоза пластинасына ауыстырып, зерттелуші сарысумен инкубациялайды. Сарысудағы антиденелер әртүрлі антигендік фракциялармен байланысады, адам иммуноглобулиніне қарсы ферментті-таңбаланған антиглобулинді сарысу көмегімен айқындалады.

4. Иммунофлюоресцентті әдіс. Мысалы, мерез серодиагностикасында қолданылады. T.pallidum құймасынан алынған шыныдағы жағындыны құрамында спецификалық антиденелері бар екендігіне күдік туындаған зерттелуші сарысумен өңдейді. Егер сарысуда спирохеталар антигендеріне қарсы антиденелер болса, олар микробпен байланысады. Антиденелердің артық мөлшері шаю арқылы шығарылады. Жағындыны адам иммуноглобулиніне қарсы флюоресценциялауыш сарысумен қосымша өңдейді. Зерттелуші сарысудағы спецификалық антиденелердің айқындалуына жағындыны люминесцентті микроскоппен қарағанда жарқыраған спирохеталардың табылуы себепкер бола алады.

Осыған ұқсас әдіспен бірқатар аутоиммунды аурулар кезіндегі қан сарысуынан антинуклеарлы антиденелерді айқындайды, ол үшін антиген ретінде жануарлардың ядролық жасушаларын пайдаланады.

5. Айқарылған агглютинация реакциясы. Алдыменен сарысудың негізгі сұйылтпасын дайындайды, одан бір шыны түтікшеден екіншіге, екіншіден үшіншіге және тағы жалғастыра 1 мл сұйықтықты ауыстыра құйып, сұйылтпа сериясын жасайды. Біркелкі мөлшер жасау үшін соңғы түтікшеден 1 мл сарысуды алып тастайды. Бақылау түтікшесіне (антиген бақылауы) 1 мл натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісін құяды. Сарысу сұйылтпалары бар әрбір түтікшеге және бақылау түтікшесіне пастер тамызғышымен 1 мл-інде 3 млрд микроб жасушысы бар 2 тамшы бактерия құймасын құяды. Түтікшелерді сілкілеп, 2 сағатқа 37°С-тық термостатқа орналастырады да бір тәулік бөлме температурасында сақтайды. Айқарылған агглютинация ракциясының нәтижесін ақырын сілкілей орып әрбір түтікшедегі өзгерістерге бағалау жүргізеді. Бақылау түтікшелерінде агглютинация болмау керек. Агглютинация реакциясының интенсивтілігі мынадай таңбалармен белгілейді: "++++" – толық агглютинация (агглютинат үлпектері айрықша мөлдір сұйықтықта), "+++" – толық емес агглютинация (агглютинат үлпектері әлсіз мөлдір сұйықтықта), "++" – жарым-жартылай агглютинация (үлпектер айқын ажыратылады, сұйықтық аздап лайсаң) "+" - әлсіз, күдікті агглютинация (сұйқытық өте лайсаң, ондағы үлпектер нашар ажыратылады) (сурет 10.2.).

Сарысу титрі ретінде оның агглютинация интенсивтілігі "++"-тен де төмен бағаланатын соңғы сұйылтпасын алады.

6. Тікелей емес гемагглютинация реакциясы. Ұсақ дисперсті ерігіш антигендермен жұмыс істегенде тікелей есем немесе пассивті гемагглютинация реакциясын қолданады (ПГАР, ТЕГАР). Антигендерді алдымен инертті монодисперсті бөлшектерде немесе жасушаларда адсорбциялайды, мысалы, эритроциттерде э р и т о р ц и т а р л ы д и а г н о с т и к у м дайындайды. Мұндай антигенмен тиектелген эритроциттер сол антигенге қарсы антиденесі бар иммунды сарысудың әсерінен бір-біріне жабысады. (сурет 10.2.2).

Сурет 10.2.1. Агглютинация

А – жақсы айқындалған,

Б – нашар айқындалған

Реакция жоғары сезімталдылығымен ерекшеленеді және зерттелуші сарысудағы салыстырмалы түрде азғантай концентрациялы антигендерді табуға мүмкіндік береді. Реакцияны пластмассалы пластинада жүргізеді, олардың ойықтарында науқас сарысуының тізбектік сұйылтпасын дайындайды. Әрбір ойыққа антигендермен тиектелген эритроциттер суспензиясының 3%-ті біркелкі көлемін (0,5мл) ендіреміз. 37°С-та 2 сағат инкубациялаған соң эритроциттер тұнбасының сипаты бойынша нәтижені ескереді.

7. Гельдегі преципитация реакциясы. Агарлы гельдегі бір-біріне қарама-қарсы әртүрлі ойықтарға құйылған антиген мен антидене ерітінділерінің иммунодиффузиясы олардың спецификалығының сәйкестілігі жағдайында реагенттер кездескен жерде жолақтар мен доғалар түріндегі спецификалық преципитаттың түзілуіне әкеп соғады.

Сурет 10.2.2. Пассивті гемагглютинацияреакциясы реакциясы

Эр – эритроциттер, Аг – антигендер, Ат – антиденелер

Әдетте, орталық ойыққа антигеннің стандартты ерітіндісін, ал шеткері ойықтарға зерттелетін сарысуларды құяды. Шеткері ойықтардың біріне сәйкес спецификалы стандартты иммунды сарысуды, ал басқасына – бақылау үшін қалыпты сарысуды ендіреді. Антигенді сарысулармен 37°С-та 24 сағат ылғалды камерада инкубациялаған соңантиген ерітіндісі бар орталық ойықпен зерттелетін сарысуы бар шеткері ойықтар арасындағы преципитеция жолағының ені мен мөлшерін ескереді.

8. Лизис реакциясы. Комплемент байланыстырушы реакция. Лизис реакицясы мен КБР қою үшін теңіз шошқаларының қан сарысуында болатын комплементті қолданады. Комплементтің гемолитикалық активтілігі термолабильді, және сарысуды 56°С-та 30 минут бойы ысытқанда толығымен жойылады. Комплементтің антиген-антидене кешенінде адсорбциясы жүрген кезде, егер антиген корпускулярлы болса, немесе көрінетіндей өзгерістерге ұшырамаса, егер ол ұсақдисперсті немесе ерігіш антиген болса оның әсері антигеннің лизис реакциясымен айқындалады. КБР нәтижелерін шығару үшін қосымша (индикаторлы) гемолитикалық жүйе енгізеді. Ол натрий хлоридінің изотоникалы ерітіндісіндегі қой эритроциттерінің және сол эритроцитермен иммунизацияланған қоянның гемолитикалық сарысуының қоспаларынан құралған. Оң нәтижелі КБР комплементтің антиген-антидене жүйесімен адсорбциялануы салдарынан болған гемолиз тежелуімен сипатталады (сурет 10.2.3). Теріс нәтижелі КБР гемолиз болуымен сипатталады, өйткені еркін комплемент қой эритроциті мен қоянның гемолитикалық сарысуынан тұратын индикаторлы антиген-антидене жүйесімен байланысады. КБР жоғары сезімталдылық пен спецификалылыққа ие, бұл оны көптеген аурулардың серодиагностикасы үшін қолдануға мүмкіндік береді.

КБР қою үшін реакцияға қатысушы барлық ингредиенттердің (зерттелуші сарысудың, антигеннің, комплементтің, қой эритроциті мен қоянның гемолитикалық сарысуының) сандық қатынасы дәл болуын талап етеді. Сондықтан негізгі тәжірибені жасау үшін гемолитикалық сарысуды титрлеу және оның жұмыстық сұйылтпасын таңдау, басқа да ингредиенттерді титрлеу қажет.

КБР қою антиген препараттары мен зерттелетін сарысуда антикомплементарлы ингредиенттердің жоқтығына көз жеткізу үшін бақылаулармен бірге жүргізілуі қажет. Антигендердің немесе сарысудың антикомплементарлы қасиеттері олардың құрамында денатурацияланған немесе агрегацияланған иммуноглобулиндердің, гепариннің, оксиданттардың, микробтық контаминанттардың бар екендігімен байланысты болуы мүмкін. Бұл компоненттер не комплементті байланыстыра алады, не комплементтке негізделген гемолизге қажетті калийдің немесе магнийдің иондарын байланыстырып жоя алады.

К о м п л е м е н т т і т и т р л е у. Титрді және жұмыстық дозаны анықтау үшін иммундық гемолиз реакциясы көмегімен комплементті титрлеу жүргізіледі (кесте 10.2.).

Сурет. 10.2.3. Комплемент байланыстыру реакциясы.

АГ – антиген; АД – антидене; Эр – эритроциттер; Гем. сарысу – гемолитикалық сарысу.

Теңіз шошқасының уыздай (свежий) сарысуын натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісінде 1:10 –нан 1:40 на дейін сұйылтады. Комплементтің әрбір сұйылтпасының 0,2 мл-не 0,4 мл-ден гемолитикалық қоспа қосады (3%-ті натрий хлоридінің изотоникалы ерітіндісіндегі эритроциттер суспензиясы мен үштік титріне сәйкес сұйылтпасындағы гемолитикалық сарысудың бірдей көлемдегі қоспасы). Шыны түтікшелерді 37°С-та 30 минут ұстап, комплемент титрін – гемолитикалық сарысу қатысуындағы эритроциттердің толық лизисін тудыратын комплементтің ең үлкен сұйылтпасын анықтайды. Комплементтің жұмыстық дозасын оның титріне сүйене есептейді. Комплементтің жұмыстық дозасы титрден 25 %-ке жоғары болуы керек. Мысалы, комплемент титрі 1:20 болса жұмыстық доза ретінде оның алдынғы 1:10 сұйылтпасын алады (кесте 10.2.1 қара).

Антигендерді өлген микроорганизмдер қоспасынан, олардың лизаттарынан, толық антигендерінен, гаптендерінен, ұлпалық экстракттерден дайындайды.

Қой эритроциттерінің қоспаларын қойдың дефибринденген қанынан алады. Ол үшін эритроциттерді натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісінде тұнба үстілік сұйықтықтың толық түссізденуі мен мөлдірленуі пайда болғанша шаяды да, олардан натрий хлоридінің изотоникалы ерітіндісіндегі 3 %-тік қоспасын дайындайды.

Гемолитикалық сарысуды қоянға қой эритроциттерінің 50 %-тік қоспасымен 3-4 мәрте қантамырлық иммунизация жасау арқылы алады да, оны 56°С-та инактивтейді (комплементтерді жою үшін). Сарысулы ампулалардың этикеткаларында оның титрі, яғни бір сағат ішінде 37°С-та комплементтің қатысуынмен 3 %-тік қой эритроциттерінің қоспасының толық лизисін қамтамасыз етуші сол сарысудың максимальді сұйылтпасы көрсетіледі. КБР үшін гемолитикалық сарысуды үштік титрде алады. (жапсармалардағы 10.2.4 сурет).

К е с т е 10.2.1. Комплементті титрлеу (хаттама қалыбы)

Іс-шаралар	Түтікшелердің нөмірлері
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Комплементті 1:15 сұйылтпасына енгізу	0,3	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-	-
Натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісін енгізу, мл	0,3	0,4	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,2	-
Түтікшеден артықтарды алып тастау, мл	0,4	0,4	0,4	0,3	0,4	0,5	0,6	-	-
Комплементтің алынатын сұйықтығы	1:10	1:15	1:20	1:25	1:30	1:35	1:40	-	-
Гемолитикалық қоспаны қосу, мл	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
37°С-та 30 минут бойы инкубациялаймыз.
Нәтижелерді есептеу

К Б Р - ы ң н е г і з г і т ә ж р и б е с і н ж а с а у. Титр мен барлық ингредиенттердің жұмыстық дозан анықтаған соң КБР-ың негізгі тәжірибесін қояды (кесте 10.2.2).

Зерттелуші және бақылаушы сарысуды алдын-ала 30 минут бойы 56°С-та қыздыру арқылы инактивтейді. КБР-сын жасаудың стандартты схемасы антигеннің, зерттелуші сарысудың және комплемент қоспасының 37°С-та 30 минут бойы инкубациясының бірінші фазасының өткізілуін қарастырады. КБР-сын суықта (0-4°С-та) жасағанда бұл фазаны 18-24 сағат бойы жүргізуге болады, ал бұл реакцияның сезімталдылығын жоғарылатады.

Әрбір түтікшеге 0,4 мл-ден гемолитикалық қоспа қосқан соң түткішелерді сілкілейді де 20-30 минут бойы 37°С ыстыққа қояды. Тәжірибе нәтижесін барлық түтікшелердегі гемолиздің бар-жоқтығын белгілей отырып бағалайды (кесте 10.2.2. қара). Түтікшедегі сұйықтық түссіз болса және эритроциттер тұнбаға түссе гемолиздің толық тежелуін көрсетеді де, реакция оң деп есептеледі, реакцияның теріс болуы сұйықтықтың интенсивті боялуымен, эритроциттердің толық лизистенуімен ("алқызыл қан") сипатталады. Гемолиздің тежелу дәрежесі сұйықтықтың боялу интенсивтілігі мен эритроциттер тұнбасының көлеміне байланысты бағаланады (++++, +++, ++, +) – 10.2.4 суретті қара.

К е с т е 10.2.2. Комплемент байланыстыру реакциясының негізгі тәжірибесі

Іс-шаралар		Шыны түтікшелер нөмірлері
		1	2	3	4	5	6	7
1:5 сұйылтпадағы зерттелуші сарысуды енгізу, мл		0,2	-	-	0,2	-	-
Әдейі "оң" етілген сарысуды енгізу, мл		-	0,2	-	-	-	-	-
Әдейі "теріс" етілген сарысуды енгізу, мл		-	-	0,2	-	-	-	-
Антигенді енгізу, мл		0,2	0,2	0,2	-	0,2	-	-
Натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісін енгізу, мл		-	-	-	0,2	0,2	0,4	0,4
Жұмыстық дозада комплементті енгізу, мл		0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
0 - 4°С-та 18-20 сағат немесе 37°С-та 30 минут бойы инкубациялау
Гемолитикалық қоспаны енгізу, мл	0,4		0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
37°С-та 30 минут бойы инкубациялау
Нәтижелерді есептеу

Бақылау ретінде (2-ші және 3-ші түтікшелер) әдейі оң және әдейі теріс сарысулармен болған реакцияларды ескереді, 4-ші және 5-ші түтікшелер сарысу мен антигеннің антикомплементарлы қасиеттерін тексеру үшін қолданылады, 6-шы және 7-ші түтікшелерде комплементтің жұмыстық дозасы мен гемолитикалық қоспаның сапасы бақыланады (кесте 10.2.2. қара).

9. Кумбс реакциясы. Толық емес (моновалентті) антиденелерді айқындаудың күрделілігі мынада: бұл антиденелер спецификалық антигендердің эпитоптарымен байланыса отырып, торша құрылымын түзбейді және антиген мен антидене арасындағы реакция не агглютинациямен де, преципитациямен де, басқа да тестілермен де айқындалмайды. Түзілген антиген-антидене кешенін айқындау үшін қосымша тест-жүйелерді қолдануға тура келеді. Толық емес антиденелерді анықтау үшін, мысалы, жүкті әйелдің қан сарысуындағы эритроциттердің резус-антигеніне реакция екі кезеңде қойылады: 1) тәжірибелік сарысудың екімәртелік сұйылтпасына құрамында резус-антигені бар эритроциттер қосады да бір сағат бойы 37°С-та ұстайды; 2) бірінші кезеңнен кейін мұқият шайылған эритроциттерге қояндық антиадамдық антиглобулиндік сарысуын (алдын-ала жұмыстық сұйылтпада титрленген) қосады. 30 минут бойы 37°С температурада инкубациядан соң нәтижені гемагглютинацияның бар-жоқтығымен бағалайды. Реакция ингредиенттеріне де бақылау қою қажет: 1) антиглобулинді сарысу + спецификалы антиденелермен әдейі сенсибилизация-ланған эритроциттер; 2) қалыпты сарысумен өңделген эритроциттер + антиглобулинді сарысу; 3) зертелуші сарысумен өңделген резус-теріс эритроциттер + антиглобулинді сарысу (сурет 10.2.5).