Сурет 5.2.1. Тауық эмбрионын залалдау әдістері.
1. Амнионды қуысқа; 2. Аллантоисты қуысқа; 3. Сарыуыз қапшығына.
В и р у с т а р д ы и н д и к а ц и я л а у ә д і с т е р і. Жасуша дақылында вирустардың бар екендігін демонстриациялау үшін бірнеше әдістер қолданады.
І. Вирустардың жасуша дақылында көбеюі (репродукциясы) олардың цитопатиялық әсері (ЦПӘ) арқылы байқалады, яғни вирустардың әсерінен пайда болған жасушалардағы морфологиялық өзгерістер микроскоп көмегімен анықталады. Мұндай жасушалардың бір бөлігі өліп, шыны қабырғасынан ысылып түседі. Бір жасушалардың жойылуы кезінде босап шыққан вирустық бөлшектер басқа жасушаларды залалдап, оларды да өлтіріп, әрі қарай ауысып отырады. Нәтижесінде біртекті жасушалық жалаң қабаттан бірең-сараң жасушалық аралшықтар қалады. Әртүрлі вирустардан туындаған ЦПӘ сипаты бірдей болмайды. Бір вирустардың репродукциясында (парамиксовирустар, герпесвирустар) жасушалардың синцитсия түзе отырып бірігулері байқалса, енді біреулерінде (энтеровирустар, реовирустар) жасушалардың әжімденуі мен деструкциясы, үшіншілерінде (аденовирустарда) жасушалардың агрегациясы жүреді. (сурет 5.2.2.). Вирустардың ЦПӘ-ін жасуша дақылдарын вирусы бар материалмен залалдап болған соң микроскоп арқылы әртүрлі мерзімде бақылай отырып, динамикасымен бағалайды. Кейбір вирустар (энтеровирустар, герпесвирустар) ЦПӘ-ін 1-2 тәулік ішінде, басқа біреулері 4-6 тәуліктен соң тудырады. ЦПӘ сипатын вирустарды индикациялау мақсатында да шамалап идентификациялау мақсатында да, яғни олардың түрлік тегін анықтауда қолданады.
Кейбір вирустарды залалдаған жасуша ядросында немесе цитоплазмасында түзген ендірмелері бойынша табуға және идентификациялауға болады. Ендірмелердің пішіндері әртүрлі болады, өлшемдері 0,25-тен 25 мкм аралығында байқалады. Олар вирустық бөлшектердің жиылыстары түрінде байқалады. Және де зақымдалған тіннен дайындалып, Романовский-Гимзе әдісімен боялған немесе флюрохроммен өңделген препараттардан анықталады. Флюрохроммен өңделген препараттарды люминесцентті микроскоппен зерттейді.
Риккетсиялармен зақымдалған жасушаларда 3-8 ші күндері цитоплазма мен ядроны түгелдей толтырып тұрған, артынша түгел қырылып қалатын көп мөлшердегі коккобациллярлы формалар байқалады. Хламидиялар Романовский-Гимзе әдісімен боялған препараттарда қарастырылады. Олар жасушаларда микроколониялар ретінде берілген цитоплазмалық ендірмелер түзеді.
Контаминацияланған жасушалардың морфологиясын зерттеу үшін жарықтандырғыш үстінде, ал объективі бұйым үстелшесі астында орналасқан арнайы инвертацияланған микроскоп қолданады. Осындай құралдың көмегімен дақылдауға арналған контейнерлар беткейіндегі жалаң қабат ретінде өсіп жатқан жасушалардың морфологиясын бағалауға болады. Жасушалардың морфологиялық өзгерісін 8х немесе 40х объективтерінің көмегімен микроскопиялық зерттеу кезінде айқындайды. Бақылау сынамасында вируспен залалданған жасушалар моноқабатын, залалданбаған жасушалармен салыстырғанда жасушалар жайылмасының толық немесе ақтаңдақтанып бұзылғанын, не болмаса вирустың ЦПӘ-сын сипаттайтын басқа да өзгерістерін байқауға болады. ЦПӘ-ін егжей-тегжейлі пайымдау үшін дақылдауға арналған контейнерге моноқабаты бар жабынды шыныны орналастырады. Сонан соң, шыныны алып, залалданған жасушаларды бекіндіріп, микроскопиялық препарат дайындайды да, оны бояп (Романовский-Гимзе, флюрохром және т.б. әдістерімен), иммерсиялық әдіспен зерттейді.
Вирустардың ЦПӘ-ін "түрлі-түсті сынама" көмегімен де көрсетілім жасауға болады: өмір сүру барысында дақылдың метоболиттік белсенді жасушалары қышқыл өнімдер бөліп шығарады да дақылдық ортадағы индикатор түсінің өзгеруін туғызады. Вирустың репродукциясы кезінде жасушалар метаболизмге қабілеттілігін жоғалтады да өледі, сондықтан уақыт өтуімен бірге орта түсі өзгермейді.
ІІ. Гемадсорбция реакциясын гемагглютининацияланатын вирустарды индикациялау үшін қолданады. Бұл реакция осындай қасиеттері бар вирустар орныққан жасуша беткейлеріне эритроциттердің адсорбциялану қабілетіне негізделген. Гемадсорбция реакциясын жасау үшін вируспен залалданған жасушалар дақылына эритроциттер қоспасын ендіріп бірнеше жанаспа уақытынан соң жасушаларды нартрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісімен шаямыз. Вируспен залалданған жасуша беткейлерінде жабысқан күйде эритроциттер қалып қояды.
ІІІ. Гемагглютинация реакциясын (ГАР) залалданған жасушалар дақылының дақылдық сұйықтығындағы, не болмаса тауық эмбрионының хорионаллантоистық немесе амниондық сұйықтығындағы гемагглютинациялаушы вирустарды табу үшін қолданады. Жануарлардың сан-алуан түрлері (тауықтар, қаздар, теңіз шошқалары) эритроциттерінің гемагглютинациясын - "бір-біріне жабысуын" қабықшасында гемагглютинині бар вирустар туғызады. Гемагглютинация реакциясын жасау үшін зерттелетін материалға эритроциттер қоспасын қосады. Эритроциттер агглютинациясы жүріп жатса, вирустың бар болғандығы.
Сурет 5.2.2. Жасушалар дақылы.
а- өзгермеген жасушалар; б- жасушалардағы цитопатиялық өзгерістер
Тауық эмбрионын кесіп жарған соң аллантоисты сұйықтықты сорып алып, 0,5 мл-ден шыны түтікшелерге немесе плексигластты пластина оймақтарына құямыз (бақылау үшін 0,5 мл залалданбаған эмбрионның осындай сұйықтығын алады). Сонан соң, 0,2 мл-ден тауықтың шайылған эритроциттерінің 1%-ті суспензиясын қосамыз да бөлме температурасында біраз ұстаймыз. Реакция нәтижелерін 40 минуттан кейін эритроциттер тұнып болған соң анықтаймыз: егер, түтікше түбінде қол шатыр түрінде бір-бірімен жабысқан эритроциттердің жұқа қабықшасы пайда болса – айқын гемагглютинация деп есептейміз де (++ ++)-пен белгілейміз, қабықша саңлаулы болса – (+++), жабысқан эритроциттердің шашақталған жиегі бар қабықша түзілсе – (++), агглютинацияланған эритроциттердің түйіршіктері аймағымен қоршалған эритроциттердің үлпілдеген тұнбасы түзілген болса – (+) белгісін қоямыз. Бақылау түтікшесінен айырмашылығы жоқ, әрі эритроциттердің айқын шектелген тұнбасы байқалса гемагглютинация реакциясы болған жоқ деп есептеп, (–) белгісін қоямыз. Тәжірибедегі шыны түтікшелерде гемагглютинацияның болуы мен бақылау түтікшелерде болмауы зерттелетін сұйықтықта вирустың бар екендігін меңзейді. ГАР титрін анықтау үшін вирусы бар сұйықтықтың 10-1,10-2,10-3 және т.б. сұйылтпаларымен реакция жүргізеді. ГАР титрі ретінде гемагглютинация (++) байқалатын максимальді сұйылтпа қолданады. ГАР титрі вирустың белсенділігін сипаттайды және де ГАТР-ын қоюда қолданады (10.2. тақырыбын қара).
Вирустық денешіктерді мөлшерлік табуы үшін титрлеу әдістері қолданады. Вирустардың титрін дақылдың ортаның 10 еселік сұйылтпаларымен немесе тауық эмбрионынан алынған материалдармен гемагглютинация реакцияларында, немесе жасуша дақылдарындағы ЦПӘ бойынша анықтауға болады. Оларды 6-7 күндік инкубациядан соң ЦПӘ бар-жоқтығына тексереді. Вирустың титрі ретінде залалданған дақылдың 50%-іне ЦПӘ берген ең үлкен сұйылтпасын қабылдайды. Вирус титрін цитопатиялық (инфекциялық) доза мөлшерімен (ИД50) атайды.
Жекеленген вирустық денешіктерді есептеудің ең нақты мөлшерлік әдісі – қабыршақ әдісі (5.2.3 сурет). Жасуша дақылын вируспен залалдап олардың жұқа қабатымен жабады. Бірнеше тәулік бойы себінділерді инкубациялаған соң агар беткейінде белігі-бір пішіндегі саңлаулы бөлімшелер (теңбілдер) пайда болады.
Бұлар жасуша дақылдарының тұтастай моноқабатында өлген жасушалар орны. Әрбір теңбіл бір вирустық денешіктің өсуі барысында түзіледі. Оны тірідей бейтарап қызылымен боялған қызыл жасушалар аясында пайда болған дөңгелек жарқын бөлімшелер арқылы байқауға болады. Осы әдіспен белгіленген вирустың титрін 1 мл-дегі теңбіл түзуші бірліктер (ТТБ) санымен атайды. Теңбілдердің өлшемдерін, морфологиясын және пайда болу мерзімін әртүрлі вирустардың түрлерінде ғана емес, сол түрдің жекеленген штаммдарында да ажыратуға болады. Аталған белгілерді штаммдардың селекциясы үшін және вирустардың таза ұрпағын алу үшін де қолданады.
