Тақырып 5.2. Вирустар мен басқа да жасушаішілік паразиттерді (риккетсиялар мен хламидияларды) дақылдау

Кіріспе. Вирустарда меншікті метаболизмі болмайды. Репродукциясы үшін олар қожайын – жасушаның метоболиттік жүйесін пайдаланады.

Вирустың жасушамен қарым қатынасының 3 типі белгілі.

1. Ө н і м д і и н ф е к ц и я. Инфекцияның бұл формасында жасушада вирустың репродукциясы жүріп, залалданған жасушадан сыртқы ортаға шығып отыратын вирустық ұрпақ – 10⁴-10⁶ вирустық денешіктер түзіледі.

2. И н т е г р а т и в т і и н ф е к ц и я. Вирус геномы қожайын – жасушаның геномына тіркеседі (интеграцияланады). Интеграцияланған вирустық геномдар – провирустар – залалданған жасушаның бөлінуі кезінде ұрпаққа беріледі. РНҚ-ды вирустар да РНҚ-тәуелді ДНҚ-полимеразаның (кері транскриптазаның) көмегімен кері транскрипция жолы арқылы интегративті инфекция туғыза алады. Мұнда жасушалық геномға вирустық РНҚ-ның түзіліп жатқан ДНҚ-көшірмесі тіркеседі. Белгілі бір жағдайларда вирустық инфекцияның интегративті формасы өнімді формаға ауысуы мүмкін.

3. А б о р т и в т і и н ф е к ц и я. Жасушаға өз бетінше репродукциялануға қабілетсіз ақаулы вирус енгенде немесе жарамды вирустың пермиссивті емес жасушаға (оның репродукциялануына қолайсыз) енуінде, немесе сыртқы ортаның қолайсыз жағдайларында абортивті инфекция пайда болады. Жасушамен өзара қарым-қатынасы ерте сатыларының бірінде үзіледі де вирус репродукцияланбайды және залалданған жасушаның ұрпағына берілмейді.

Әдістемелік нұсқаулар

Вирустарды дақылдау әдістері. Вирустарды дақылдау үшін жасуша дақылы, тауық эмбрионы және сезімтал зерттханалық жануарлар қолданылады. Бұл әдістер риккетсиялар мен хламидияларға да қолданылады.

Ж а с у ш а д а қ ы л д а р ы. Зертханалық жағдайларда дақылданатын адамдардың немесе жануарлардың соматикалық немесе эмбриональді жасушалары ретінде беріледі. Жасушалық дақылдар алыну көзі, in vitro көбеюге қабілеттілігі мен кариотипі бойынша ажыратылады. Жасуша дақылдары алғашқы (қайта дамымайтын), жартылай қайта дамитын және қайта дамитын болып бөлінеді.

Жасушалардың алғашқы дақылдары тікелей көпжасушалы микроорганизмдердың тіндерынан алынады. Мұндай жасушалар, әдетте, бөлінуге қабілетсіз (қайта дамымайды) және бір мәрте ғана қолданылады.

Жартылай қайта дамитын дақылдарға шектеулі in vitro көбеюге қабілетті әртүрлі тіндер мен мүшелердің диплоидты жасушалары жатады. Олар бір жылға дейін 20-50 мәрте ауыстырып себу жасау үрдісінде қолданылушы тіннің сомтикалық жасушаларына тән диплойдты хромосомалық жиынтығын сақтап қалатын жасушалық жүйе ретінде беріледі. Дақылдау кезінде диплойдты жасушалар қатерлі қайта туындауға шалдықпайды, сонысымен де тиімді түрде ісік жасушаларынан ерекшеленеді.

Қайта дамитын жасуша дақылдарын белгілі бір жағдайларда шектеусіз in vitro көбею қабілетіне ие қатерлі жасушалар қатарынан дайындайды. Оларға, мысалы, алғашқы рет жатыр мойынының карциномасынан бөліп алынған қатерлі HeLa жасушалары, лимфоидты карциномадан алынған Hep-3 және т.б. жатады.

Жасушалық дақылдарды өсіріп-өндіру үшін құрамында энергия көзі, минеральді заттар, аминоқышқылдар, витаминдер және басқа өсу факторлары бар күрделі құрылымды қоректік орталар қолданылады. Жасушалар орта рН-ның өзгеруіне өте сезімтал. Ортаның рН-н бақылап тұру үшін индикатор қосады. Жасушалық дақылдардың көбісі дақылдауға арналған контейнер (шыны түтікше, пластикалы планшет немесе төртқырлы құты) беткейіне берік бекіне отырып жалаң қабат түрінде өседі. Кейбір жасуша типтері суспензияларда өсуге де қабілетті.

Жасушалардың біріншілік дақылдарын дайындау бірнеше кезектік кезеңдерден тұрады: ұлпаны майдалау, трипсинизация жолымен жасушаларды даралау, оқшауланған жасушалардың алынған біртекті суспензиясын трипсиннен шайып олардың өсуін қамтамасыз ететін қоректік орталаға себу (мысалы, бұзаудың қан сарысуы қосылған № 199 ортаға). Тұну барысында жасушалар шыны ыдыстың ішкі беткейіне берік бекіне отырып, жалаң қабат түрінде орналасады. Өмір сүруге бейім жасушалар дақылы алынған соң оларды риккетсиясы, хламидиясы немесе вирусы бар материалдармен залалдайды. Аталған микробтар сол жасушалар ішіне еніп, сонда көбейеді.

Жасуша ішілік паразиттер өздерінің репродукциясы жүретін жасушаларға цитопатиялық әсер (ЦПӘ) береді. ЦПӘ залалданған жасушалардың деструкциясы (лизисі), олардың морфологиясының өзгеруі (жасушаның немесе оның ядросының өлшемдері мен пішіндерінің өзгеруі, вирустардың синцитсия түзе отырып жасуша ішілік шоғырлануы ретінде берілетін вакуольдар мен ендірмелердің пайда болуы) және функцияларының бұзылуы ретінде айқындалады.

Т а у ы қ э м б р и о н д а р ы. Тауық эмбриондары жасуша дақылдарымен салыстырғанда вирустармен және микоплазмалармен едәуір сирек контаминацияланады, сонымен қатар, әртүрлі әсерлерге қарсы жоғары тұрақтылық пен өміршеңділік қасиеттеріне ие. Олар адамға патогенді хламидияларды, риккетсияларды және қайсы-бір вирустарды дақылдауға да жарамды.

Диагностикалық мақсатта риккетсиялар мен хламидиялардың және бірқатар вирустардың таза дақылдарын алу үшін және де әртүрлі препараттарды (вакциналар, диагностикумдер) дайындау үшін 8-12 күндік тауық эмбрионын қолданады. Бұл әдістің кемшілігіне эмбрионды жармайынша зерттелетін микроорганизмді табу мүмкін еместігі, және де ақуыздар мен басқа да қосылыстар мөлшерінің көп болуы салдарынан әртүрлі препараттарды дайындау кезінде қоздырғышты тазалап алу қиындығы жатады.

Тауық эмбриондарын залалдау үшін зерттелетін материалды олардың амнионды және аллантоисты қуыстарына, хорион-аллантоисты қабықшасына немесе сарыуыз қапшығына ендіреді. (сурет 5.2.1).

Аллантоисты қуысқа залалдау үшін қайшыменен, скальпельменен немесе арнайы бұрғыменен ақ қабықтың кеуекті камерасы үстінен кішкене саңлау жасаймыз (жұмыртқаны жарыққа қарсы ұстап тұрып оның шекарасын қаламмен сызып аламыз). Кеуекті камера шегінен 2-3 мм төменгі тереңдікке 0,1-0,2 мл вирусы бар материалды шприцпен ендіреміз. Ақ қабықтағы саңлауды еріген парафинмен тығындаймыз. Залалданған эмбриондарды жару вирустардың максимальді жинақталу мерзімінде жүргізіледі (37°С та инкубациялаудың 48-72 сағаттарынан соң). Спиртпен немесе 2% йод ерітіндісімен өңдеген соң қайшыменен кеуекті камераның шекарасын қалам сызығы ізінен сәл жоғары ала, ақ қабықты кесеміз. Кесіп жатқанда ақ қабық кеуекке түсіп кетпеу үшін жұмыртқаны аздап еңкейтіп ұстаймыз. Кесілген ақ қабықты сыртқа тастаймыз да, абайлап, оның астындағы қабықшаны ашып, хорион-аллантоисты қабықшадағы залалдау орны айналасын қараймыз. Егер вирус репродукциясы жүріп жатса, зақымдалу ошағы – геморрагиялар, теңбілдер т.б. байқалады. Сонан соң, хорион-аллантоисты қабықшаның қан тамырларынан бос бөлігін Пастер тамызғышымен тесіп өтіп, аллантоисты сұйықтықты сорып аламыз. Соңында хорион-аллантоисты қабықшаны алып, натрий хлоридінің ерітіндісімен екі мәрте шайып, Петри табақшасына саламыз да қара фонда спецификалық зақымдалуларды байқайды.

З е р т х а н а л ы қ ж а н у а р л а р. Жануарлардың түрлік сезімталдылығы, олардың жасы вирустардың репродуктивті қабілетіне ықпал етеді. Көптеген жағдайларда тек жаңа туылған жануарлар қандайда бір болмасын вирусқа сезімтал (мысалы, тышқан балалары Коксаки вирустарына). Облигатты жасуша ішілік паразиттерді зертхана жануарлары ағзасында дақылдау әдісінің басқалардан артықшылығы – жасуша дақылдары мен тауық эмбрионында нашар репродукцияланатын вирустарды бөліп алуға мүмкіншіліктің болуында. Жетіспеушілігі – тәжірибедегі жануарлардың бөгде вирустармен және микоплазмалармен контаминациялану мүмкіндігінің жоғары болуында, және де жасуша дақылдарын сол вирустың таза дақылын алу үшін тағы да залалдау қажеттілігінде. Бұл зерттеу мерзімін ұзарта түседі.