Умови культивування ізольованих тканин і клітин рослин та їх вплив на синтез бар

На біосинтез вторинних метаболітів впливають походження тканин, три­валість їх вирощування іп vitrо, мінеральний склад живильного середовища, рівень, типи і співвідношення екзогенних регуляторів росту, фізичні фактори.

Перш за все вихід продукту залежить від генотипу рослини-донора. Показано, що культури клітин, отриманих від високопродуктивних рослин, продукували більше число метаболітів. Інший важливий чинник - склад поживного середовища і концентрація його компонентів, які повинні забезпечувати, з одного боку, збільшення кількості клітин-продуцентів, з іншого - підсилювати сам процес синтезу. На зростання, тобто на збільшення біомаси, істотно впливає природа і кількість вуглеводів, сполук азоту і фосфору, на синтез метаболітов - природа і концентрація фітогормонів. Так, при заміні одного ауксина на іншій, наприклад нафтилоцтової кислоти на 2,4-d, триразово збільшився синтез антрахінону суспензійною культурою Morinda citrifolia.

У зв'язку з тим що в житті людини найбільше значення мають насінні рослини, методи і умови для їх культивування розроблені краще, ніж для голонасіних рослин або водоростей, вирощування яких в стерильних умовах викликає певні затруднення. Проте незалежно від приналежності рослин до тієї або іншої таксономічної групи існують загальні вимоги до вирощування об'єктів в культурі in vitro.

Асептика. Перш за все культивування фрагментів тканини або органу рослини - експлантів, а тим більше окремих клітин вимагає дотримання повної асептики. Мікроорганізми, які можуть потрапити в живильне середовище, виділяють токсини, що інгібують ріст клітин і що приводять культуру до загибелі. Тому при всіх маніпуляціях з клітками і тканинами при культивуванні in vitro дотримуються певних правила асептики в ламінар-боксі або в асептичних кімнатах. У першому випадку асептика досягається подачею профільтрованого стерильного повітря, направленого з ламінар-боксу назовні, на того, що працює. Асептичні кімнати стерилізують за допомогою ультрафіолетових ламп, а працюють в таких приміщеннях в стерильному одязі. Робочу поверхню столів в асептичних кімнатах і інструменти перед роботою додатково стерилізують спиртом.

Чистий посуд, заздалегідь загорнутий в папір або у фольгу, інструменти, папір, вату стерилізують сухим жаром в сушильній шафі при температурі 160°С протягом 1,5-2 год. Живильні середовища стерилізують в автоклаві при температурі 120°С і підвищеному тиску протягом 15-20 хв. Якщо до складу живильних середовищ входять речовини, що руйнуються при автоклавуванні їх слід стерилізувати шляхом фільтрації через бактеріальний фільтр. Потім стерильні профільтровані компоненти додають в проавтоклавоване середовище, охолоджене до температури 40°С.

Рослинні тканини самі по собі можуть служити серйозним джерелом зараження, оскільки на їх поверхні завжди знаходиться епіфітна мікрофлора. Тому необхідна поверхнева стерилізація, яку проводять наступним чином. Попередньо частину рослини з якої буде вилучено експлант, промивають водою з милом і ополіскують чистою водою. Потім рослинний матеріал стерилізують в розчинах дезінфікуючих речовин. Деякі з цих речовин, а також час стерилізації наведено в таблиці.

Таблиця