Ізольовані протопласти, їх отримання і культивування

Вперше термін «ізольовані протопласти» був запропонований Д. Ханстейном в 1880 р. Протопласт в цілій клітині можна спостерігати під час плазмолізу. Ізольований протопласт - це вміст рослинної клітини, оточений плазмалемою. Целюлозна стінка у даного утворення відсутня. Ізольовані протопласти - одні з найбільш цінних об'єктів в біотехнології. Вони дозволяють досліджувати різні властивості мембран, а також транспорт речовин через плазмалему. Головна їх перевага полягає в тому, що в ізольовані протопласти достатньо легко вводити генетичну інформацію з органел і клітин інших рослин, прокаріотичних організмів і з клітин тварин. Е. Коккинг встановив, що ізольований протопласт завдяки механізму піноцитозу здатний поглинати з навколишнього середовища не тільки низькомолекулярні речовини, але і крупні молекули, частинки (віруси) і навіть ізольовану органелу.

Велике значення в створенні нових форм рослин для вивчення взаємодії ядерного генома і геномів органели має здатність ізольованих протопластів зливатися, утворюючи гібридні клітини. У такий спосіб можна добитися отримання гібридів від рослин з різним ступенем таксономічної віддаленості, але які володіють цінними господарськими властивостями.

Вперше протопласти були виділені Дж. Клернером в 1892 р. при вивченні плазмолізу в клітинах листка тілорізу (Stratiotes aloides) під час механічного пошкодження тканини. Тому цей метод названий механічним. Він дозволяє виділити лише невелику кількість протопластів (виділення можливе не зі всіх видів тканин); сам метод тривалий і трудомісткий. Сучасний метод виділення протопластов полягає у видаленні клітинної стінки за допомогою поетапного використання ферментів для її руйнування: целюлази, геміцеллюлази, пектинази. Цей метод отримав назву ферментативного.

Перше успішне виділення протопластов з клітин вищих рослин даним методом зроблене Е. Кокінгом в I960 р. В порівнянні з механічним ферментативний метод має ряд переваг. Він дозволяє порівняно легко і швидко виділяти велику кількість протопластів, причому вони не відчувають сильного осмотичного шоку. Після дії ферментів суміш протопластів пропускають через фільтр і центрифугують для видалення незруйнованих клітин і їх осколків.

Виділити протопласти можна з клітин рослинних тканин, культури калусів і суспензійної культури. Оптимальні умови для ізоляції протопластів для різних об'єктів індивідуальні, що вимагає кропіткої попередньої роботи по підбору концентрацій ферментів, їх співвідношення, часу обробки. Дуже важливим чинником, що дозволяє виділяти цілі життєздатні протопласти, є підбір осмотичного стабілізатора. Як стабілізатори зазвичай використовують різні цукру, іноді іонні осмотики (розчини солей Сасl₂, Na₂hp0₄, Kc1). Концентрація осмотиків повинна бути небагато гпертонічна, щоб протопласти знаходилися в стані слабкого плазмолізу. В цьому випадку гальмуються метаболізм і регенерація клітинної стінки.

Ізольовані протопласти можна культивувати. Зазвичай для цього використовують ті ж середовища, на яких ростуть ізольовані клітини і тканини. Відразу ж після видалення ферментів у протопластів в культурі починається утворення клітинної стінки. Протопласт, що регенерував стінку, поводиться як ізольована клітка, здатний ділитися і формувати клон клітин. Регенерація цілих рослин з ізольованих протопластов зв'язана з рядом труднощів. Отримати регенерацію через ембріогенез вдалося поки тільки у рослин моркви. Стимуляцією послідовного утворення коріння і пагонів (органогенез) добилися регенерації рослин тютюну, петунії і деяких інших рослин. Слід зазначити, що протопласти, ізольовані з генетично стабільної клітинної культури, частіше регенерують рослини і з великим успіхом використовуються при дослідженнях генетичної модифікації протопластів.