Типи культур клітин і тканин калусогенезу

Залежно від способу, умов культивування і походження можна виділити декілька типів культур клітин і тканин. Якщо культивування відбувається поверхнево на агаризованому поживному середовищі, то утворюється калусна тканина. При культивуванні в рідкому поживному середовищі (глибинний спосіб культивування) утворюється суспензійна культура клітин. Великий інтерес представляє культура одиночних клітин, а також культивування ізольованих протопластів.

Калусна тканина не має чітко вираженої структури, але може розрізнятися по щільності. Походження і умови вирощування визначають, чи буде калусна тканина рихлою, середньої щільності або щільною. Рихла калусна тканина має сильно оводнені клітини, які легко розпадаються на невеликі групи клітин і кластери і тому може бути використана для отримання суспензійної культури. Тканина середньої щільності характеризується добре вираженими меристематичними вогнищами. У ній легко ініціюються процеси органогенезу. У щільних калусних тканин розрізняють зони редукованого камбію і трахєїдоподібних елементів.

Суспензійна культура клітин утворюються як з калусних тканин, так і безпосередньо з експланта. Серед калусних тканин для одержання суспензійних культур переважно вибирають калуси рихлого типу. При необхідності використовувати щільний каллус, то його можна розпушити, виключивши з поживного середовища солі Са²⁺. З цією ж метою можна культивувати тканину на середовищі, що містить ауксин 2,4-d або ферменти, - пектиназу (0,2 міліграм/л) і целюлазу (0,01 міліграм/л). Найкращий ефект досягається при додаванні ферментів. Суспензійні культури клітин можна отримати і безпосередньо з експланта по методу Ф. Стюарда. Для цього експлант поміщають в рідке середовище при постійному автоматичному перемішуванні. Дедіфференцированниє клітини відриваються від експланта, утворюючи суспензію в поживному середовищі. Постійне струшування - необхідна умова культивування клітинних суспензій. Суспензійні клітини діляться у присутності тих же двох груп гормонів (ауксинов і цитокинінов), які індукують ділення клітин в каллусних тканинах. Отже, можна сказати, що суспензійні культури представлені різними агрегатами каллусних клітин.

Клітинні суспензії відіграють значну роль в біотехнології. Вони можуть бути використані для отримання ізольованих протопластів, які застосовують для клітинної селекції, при введенні чужорідної ДНК і інших процесах. Клітинні суспензії культивують у великих кількостях для отримання вторинних метаболітов, виявлення нових речовин, для вирощування клітинної біомаси. Проте збільшення клітинної біомаси в результаті ділення клітин і синтез вторинних метаболітов роз'єднані в часі. Тому необхідно добре знати фізіологію, властивості клітин в суспензійних культурах, щоб отримати максимальний вихід продукту. Стан клітинних суспензій характеризується щільністю клітинної популяції. За 14-16 днів (середня тривалість пасажу) щільність зазвичай підвищується від 5•10⁴ до 5•10⁶ кл/мл. Якість суспензії визначається ступенем агрегированноє™. Агрегати повинні містити не більше 10-12 клітин.

Культура одиночних клітин застосовуються в клітинній селекції для відбору гібридних клітин і їх клонування, а також для генетичних і фізіологічних досліджень. Наприклад, питання про причини генетичної неоднорідності легко вирішувати, використовуючи клон-потомство однієї клітини, а не гетерогенну тканину початкового експланта.

Проте культивування однієї або декількох клітин пов'язане з певними труднощами, що полягають в тому, що одиночна клітина живе, але не ділиться в тих умовах, які розроблені для нормального зростання і розмноження клітин каллусной тканини. Тому при культивуванні одиночних клітин було потрібно вироблення спеціальних методів. Всі вони засновані на використанні так званого «кондиціонуючого чинника» - метаболітов, що виділяються клітинами, що в середу діляться. Коли на живильне середовище висаджується одна клітка або невелика їх кількість, вони не діляться, оскільки кондиціонуючого чинника, що виділяється, не вистачає для індукції ділення. Отже, необхідно підвищити концентрацію чинника в поживному середовищі. Цій меті служать наступні методи:

1 . Метод тканини-«няньки» - кондиціонуючий чинник виділяється шматочками тканини-«няньки», що знаходяться поряд з одиночною клітиною (мал. 6.1).

Мал. 6.1. Вирощування окремих клітин за допомогою тканини-«няньки» (по Р. Г. Бутенко, 1999):

1 - одиночні клітини; 2 - калусна культура-«нянька»

2. Метод «годуючого шару» - кондиціонуючий чинник виділяють клітини суспензійної культури того ж виду рослин, що активно діляться, що і одиночна клітка (мал. 6.2).

Мал. 6.2. Використання культури суспензійних клітин як «годуючий шар» для вирощування ізольованих протопластів і одиночних клітин кукурудзи (By Дик Куанг, З.Б.Шаміна, 1985):

1 - колонії клітин; 2 - фільтрувальний папір; 3 - алюмінієва сітка; 4 - пінополіуретан; 5 - суспензія клітин

3. Кондиціонування середовища - здійснюється шляхом додавання в нього поживного середовища, відфільтрованого від клітин, що інтенсивно діляться.

4. Метод культивування одиночних клітин - здійснюється в мікрокраплі, тобто в дуже малому об'ємі (20 мкл) багатого живильного середовища (Ю.Ю.Глеба).

Точно сказати, що є кондиціонуючим чинником, поки неможливо. Згідно дослідженням А.І.Павлової і Р. Г. Бутенко (1969), цей чинник водорастворім, термостабілен, не замінюється фітогормонамі, включає низькомолекулярні речовини. Хімічна природа кондиціонуючого чинника доводиться за допомогою задоволеного простого експерименту. Якщо розділити одиночні клітини і ткань-«няньку» скляною пластиною, то ділення клітин не наступає. Якщо замість пластин помістити целофан, то хоча і із затримкою починається ділення одиночних клітин (мал. 6.3).

Мал. 6.3. Доказ хімічної природи чинника кондиціонування:

1 - одиночні клітини; 2 - тканина-«нянька»; 3 - клітини, що діляться; 4 - целофан; 5 - скляні пластинки