Використання методу культури ізольованих клітин і тканин в синтезі біологічно активних речовин культура клітин як продуцент вторинних сполук

Здатність інтактних рослин синтезувати різні сполуки привела до припущення, що тією ж властивістю володітимуть клітини і тканини цих рослин, що вирощуються в стерильних умовах. У 50-х роках минулого століття це було доведено на практиці. Але в окремих випадках клітини або не проявляли здібності до синтезу необхідних речовин, або синтезували їх в мінімальних кількостях. Знадобилися довгі експерименти по підбору поживних середовищ, умов культивування, дослідженню нових штамів, отриманих завдяки генетичній гетерогенності калусних клітин або застосуванню мутагенних чинників, щоб добитися серйозних успіхів в цій області. Одержання клітинних культур для виробництва біологічно активних речовин можливе з будь-якої тканини або органа цілої рослини, вирощеної у відкритому чи закритому ґрунті, а також часто для цього використовують стерильні проростки, отримані з насіння в умовах іп vitrо.

Синтез вторинних метаболітів звичайно здійснюється після завершення клітинного росту, маса їх порівняно незначна і лише внаслідок специфічних умов культивування і мутаційних змін можливо викликати надсинтез вторинних метаболітів. Вторинні метаболіти синтезуються у вигляді комбінації кількох різних хімічних сполук.

Деякі з цих речовин, наприклад окремі органічні кислоти, що утворюються в рослинах, відразу використовуються клітинами для різних біосинтетичних процесів; вони не накопичуються в рослинах у великій кількості і є проміжними продуктами обміну речовин. Для виділення їх із рослин інколи потрібно перервати або якимось чином змінити ланцюг закономірних перетворень речовин у клітині, тобто відвернути подальше використання цих речовин. Найчастіше це вдається зробити шляхом індукції та добору відповідних біохімічних мутацій. Рослини з такого типу мутаціями, як правило, не життєздатні, але можливо отримати подібні мутації на клітинному рівні за допомогою методів клітинної селекції

Багато речовин вторинного метаболізму — це найважливіші фізіологічно активні речовини, наприклад терпеноїди (сюди належать регулятори росту гібереліни) або убіхінони та пластохінони, які відіграють найважливішу роль у процесах дихання та фотосинтезу. Тому термін «речовини вторинного метаболізму» поступово замінюється на термін «речовини спеціалізованого обміну». Деякі з цих речовин значною мірою визначають харчові та смакові якості різних рослинних продуктів, багато з них широко застосовують в медицині, харчовій та косметичній промисловості, техніці.

Завданнями майбутніх досліджень, здатних перетворити біотехнологію лікарських рослин і фітопрепаратів на рутинну промислову технологію, є поглиблене вивчення генетики вторинного метаболізму; виділення та клонування відповідних генів, що дають змогу створювати високопродуктивні штами і генетично-модифіковані рослини із застосуванням сучасних методів генетичної інженерії (метаболічна інженерія біосинтезу вторинних метаболітів); подальше удосконалення промислової технології вирощування ізольованих органів, тканин і клітин рослин шляхом її спрощення; здешевлення технологічного обладнання біотехнологічних виробництв.

Різними вченими в різні періоди було одержані ті чи інші природні сполуки з культур тканин, властиві інтактним рослинам. Одержані здобутки можна представити у вигляді таблиці.

Таблиця

	Рослини	Вторинний метаболіт
	Блекота чорна Hyosciamus nigeri
	Гваюла Parthenium argentatum	каучук
	Беладонна Atropa beladonna -	атропін - алкалоїд
	Мак снодійний Papaver somniferum	Кодеїн - болезаспокійлива речовина
	Наперстянка Digitalis lanatd	Діоксин - тонізує серцеву діяльність
	Хінне дерево Cinchona ledgeriana	антималярійний засіб «хінідин».
	Тютюн N. tabacum	скополетин і чотири глікозиди, три з яких ідентифіковані як скополин, фабіатрин і b-гентибіозид.
	Агава А. toumeyana	синтезують гекогенін - попередник стероїдних гормонів.
	Діоскорея D, composita	Діосгенін - попередниками стероїдних гормонів.

Клітинна біотехнологія лікарських рослин бурхливо розвивається в різних країнах у промислових масштабах одержують убіхінони, антоціани, алкалоїди.

Вивчались особливості росту культури тканин женьшеню Pаnаx ginseng, барвінку Vinca rosea, раувольфії Rauwolfia serpentina, стефанії Stephania rotunda та деяких інших представників родини аралієвих, різних видів роду раувольфія.

Культури тканин різних видів рослин здатні синтезувати антимікробні сполуки, які діють проти грампозитивних мікроорганізмів. Ці біологічно активні речовини виявляються як у вихідній рослині, так і в культурі її тканин, а в деяких випадках лише в культивованих клітинах за повної відсутності в інтактних рослинах.

У зв'язку з високою фармацевтичною цінністю стероїдних гормонів вста­новлена перспективність використання калусних і суспензійних культур агави А. toumeyana та діоскореї D, composita для їх виробництва.

Не менша увага приділяється і культурам тканин рослин, які в природі накопичують глікозиди, особливо карденоліди - серцеві глікозиди. На наявність глікозидів були досліджені культури тканин представників видів Атті, Aросупит, Cheiranthus, Cytisus, Digitalis, Iberis, Oleander, Periploca, Taxus, Urginea, Vincetoxicum. Найінтенсивніше вивчались види роду наперстянок Digitalis, які є основною сировиною для промислового одержання серцевих глікозидів. Культури тканин різних органів видів Digitalis lanata, D. purpurea, D. mertonensis здебільшого карденоліди накопичують дуже мало (не більше 0,02 %) і лише протягом перших субкультивувань, до того ж синтезовані сполуки не завжди аналогічні глікозидам інтактних рослин. Тому метою досліджень було вивчення біотрансформації глікозидів і попередників їх біосинтезу культурами ізольованих тканин і клітин.

Великий інтерес викликало відкриття піретринів, виділених з квіток Chrysanthemum cinerariaefolium. Ці речовини - могутні інсектициди. Особлива їх цінність полягає в тому, що піретрини не викликають звикання у комах, а також не проявляють кумулятивного токсичного ефекту.

Синтез вторинних метаболітів в культивованих клітинах пов'язаний з внутрішньою органелою, в основному з пластидами і ендоплазматичним ретикулумом. У клітинах, не здатних до транспорту метаболітів, продукти вторинного синтезу зазвичай накопичуються у вакуолях і вільному просторі (ВП) клітин (табл. 1).

Таблиця 1

Внутрішньоклітинна локалізація синтезу і накопичення вторинних метаболітов (по Р.Г.Бутенко, 1999)

Внутрішньоклітинні метаболіти	Синтез	Накопичення
Алкалоїди	Пластиди, цитоплазма	Вакуоль, хлоропласти, ВП
Терпеноїди: Монотерпени Тритерпени	Лейкопласти Хлоропласти, лейкопласти	ВП Вакуоль, ВП, цитоплазма
Феноли: Флавоноїди Таніни Кумаріни Оксикоричні кислоти	Хлоропласти Вакуоль, пластиди Вакуоль, хлоропласти ЕПР, ЕПР, хлоропласти, мітохондрії	Вакуоль, хлоропласти, ВП Вакуоль, ВП, ЕПР Вакуоль Вакуоль, ВП, хлоропласти
Ціаногенні глікозиди	ЕПР	Вакуоль
Глікозиди	ЕПР	Вакуоль
Бетаїн	Імовірно цитоплазма	Вакуоль

Культури клітин деяких рослинних видів здатні синтезувати різноманітні вторинні метаболіти в концентраціях, близьких і навіть більш високих, ніж інтактні рослини. На сьогодні такі високопродуктивні, а також трансформовані культури, в які перенесено гени, що забезпечують синтез цільового продукту, широко використовують в промисловому виробництві біопродуктів. Наприклад, вихід аймаліцина і серпентину в культурі клітин Catharanthus roseus складає 1,3 % сухої маси, а в цілій рослині - 0,26 %. У культурі клітин Dioscorea deltoidea діосгенін синтезується в кількості 26 міліграм на 1 г сухої маси, а в бульбах рослин його вміст складає 20 міліграм на 1 г сухої маси.

Під час культивування клітин і тканин може початися синтез речовин, не характерних для початкової рослини, або розширюється набір сполук, що синтезуються, тобто з'являється можливість одержання нових речовин шляхом додавання до культивованих клітин природних проміжних продуктів, потрібних для біосинтетичних процесів. Такий підхід становить практичний інтерес у разі створення або модифікування лікарських препаратів. У ряді випадків в клітинній культурі утворюються речовини, які синтезувалися інтактною рослиною на ювенільній фазі розвитку, або речовини, що містилися в клітинах філогенетично раніших груп рослин. Так, в культурі клітин Papaver bracteatum міститься сангвірин, характерний для ювенільних рослин, і відсутній тебаїн, що синтезується дорослими рослинами. А в культурі клітин жівокості (Delphinium) синтезуються ∆⁷-стеріни, присутні у архаїчних груп рослин. На сьогодні відомо понад 100 000 вторинних метаболітів рослинного походження, в культуру іп vitrо введена переважна більшість цих рослин. У книгах видавництва «Шпрінгер» детально описано особливості культури тканин лікарських рослин із близько 300 родів. Деякі з таких культур накопичують в 10-30 разів більше цільового продукту, ніж природні рослини. Відомі приклади, коли кількість вторинного метаболіту перевищує його вміст у рослині в 100 разів (наприклад, для клітин раувольфії зміїної, що накопичують до 20 % алкалоїду аймаліну). За достатньої продуктивності культури і ціни (дол. США) кінцевого біотехнологічного продукту (аймаліцину - 1500 дол./кг, шиконіну - 4000 дол./кг, камптотецину і його похідних – 5000-25 000 дол./кг) технології рентабельні (слід зазначити, що ціна протипухлинного алкалоїду таксолу, що накопичується деякими деревними рослинами роду тис Тахиs, перевищує 200 000 дол./кг). Культури таких клітин вирощують в промислових масштабах, а отриману сировину використовують для виробництва лікарських препаратів. Нині, розробляючи новий фітопрепарат чи препарат на основі природних сполук рослинного походження, як джерело сировини вказують одночасно на інтактні рослини і на клітинну біомасу, вирощену іп vitrо.

Синтез вторинних сполук може корелювати з процесом диференціювання в культурі клітин. Наприклад, в суспензійній культурі Papaver somniferum максимальний синтез алкалоїдів починається після того, як в ній диференціюється достатньо велика кількість спеціалізованих клітин молочних судин, призначених для депонування метаболітів. З іншого боку, культури клітин тютюну і моркви синтезують велику кількість нікотину і антоціану відповідно, хоча їх клітини слабо диференційовані.

Не існує також однозначної відповіді на питання, як пов'язаний синтез вторинних метаболітов з ростовими процесами. У великого числа культур вторинні метаболіти синтезуються і накопичуються в значних кількостях або під час експоненціальної фази, коли ростові процеси особливо активні, або в період стаціонарної фази зростання культури клітин, коли приріст клітинної маси припиняється. Проте є культури, наприклад культура клітин Catharanthus roseus, у яких синтез вторинних метаболітів супроводжує весь період росту.

Важлива особливість культивованої популяції клітин - її стабільність відносно синтезу і накопичення продуктів вторинного синтезу. Так, у відділі біології клітини і біотехнології ІФР РАН під керівництвом Р. Г. Бутенко були отримані різні штами клітин Dioscorea deltoidea, зокрема штам-надпродуцент ІФР ДМ-0,5. Всі ці штами зберігали стабільність відносно синтезу фуростанолових глікозидів біля 26 років. Цікава особливість більшості клітин в культурі полягає в тому, що зазвичай ці клітини не транспортують метаболіти, що синтезуються, в поживне середовище або інші клітини, хоча деякі культури становлять виняток, зокрема культура клітин маку, які депонують алкалоїди в молочних судинах.

Незважаючи на ряд переваг, є багато причин, які стримують виробництво біологічно активних речовин у біореакторах. Здебільшого органи або тканини, що продукують у живій рослині відповідні речовини, внаслідок введення їх у культуру не синтезують ці речовини або синтезують їх у незначних кількостях. Потрібна тривала селекційна робота для того, щоб культура змогла досягти оптимального рівня виробництва біологічно активних речовин.

Порівняно з мікроорганізмами рослинні клітини ростуть повільніше. Для подвоєння рослинних клітин у культурі іп vitrо у середньому потрібно в 20 разів більше часу, ніж із подвоєнням кількості клітин мікроорганізмів. Виробництво у великих масштабах ускладнюється внаслідок того, що слід дотримуватись спеціальних заходів для запобігання повторній інфекції у разі тривалого процесу виробництва.

У багатьох клітинних культур під час виробництва вторинних біопродуктів виявляється нестабільність. Для промислового виробництва потрібні такі клітинні культури, що мають високу продукуючу стабільність. Часто здатність селектованих ліній клітин виробляти відповідні біопродукти в необхідній кіль­кості зменшується після кількох субкультивувань. Механізми, що сприяють протіканню цих важливих процесів, різноманітні й усе ще вивчаються.

Суспензійні культури рослин здебільшого складаються з агрегатів клітин різноманітного розміру. Це означає, що клітини на поверхні агрегату й у його центрі не ідентичні, що ускладнює оптимізацію процесу виробництва вторинних біопродуктів. Встановлено, що під час утворення агрегатів різного розміру між клітинами виникають морфологічні розбіжності, які в умовах масового ви­робництва поглиблюються ще більше і спричинюють високу гетерогенність культури та ускладнюють ферментативне культивування. Крім того, деякі культури клітин перетворюють позаклітинну сахарозу на полісахариди, які збільшують агрегування клітин. Встановлено, що виробництво відповідного вторинного продукту в потрібній кількості часто пов'язане з індукцією органогенезу клітинної культури. Наприклад, у женьшеню отримані клони, що мають високий вміст глікозидів під час переходу до ризогенезу, а у маку лише в органогенній культурі відбувається біосинтез морфінів. Це створює чимало труднощів за умови масового культивування. Вторинні продукти у більшості рослинних культур не виділяються в середовище, а залишаються усередині клітин. Це властиве культурам, що синтезують алкалоїди (наприклад, раувольфія зміїна), і ускладнює екстрагування. Часто методи екстрагування й очищення відрізняються від методів, що застосовуються для природної рослинної сировини. Внаслідок великих розмірів культивовані клітини рослин чутливі до перемішування і постачання киснем. Все це потребує конструювання спеціальних ферментерів (біореакторів).