Загальна характеристика калусних клітин

Вирощування ізольованих клітин і тканин на штучних живильних середовищах в стерильних умовах (in vitro) отримало назву методу культури ізольованих тканин.

Калусна клітина має свій цикл розвитку, аналогічний циклу всіх інших клітин: поділ, розтягування, диференціювання, старіння і відмирання. Ріст калусних тканин підкоряється загальним закономірностям, тобто крива росту калусних тканин має характер S-подібної кривої (ростова крива Сакса) і включає п'ять фаз, тривалість яких неоднакова у різних видів рослин (мал. ).

П ерша фаза - латентна, або лаг-фаза, полягає в підготовці клітин до поділу.

Друга - фаза експоненціального росту (логарифмічна). У цей час мітотична активність найбільша, ріст іде з прискореням маса калуса збільшується.

Третя фаза - лінійна, характеризується постійною швидкістю росту калусной маси.

Четверта - фаза сповільненого росту, під час якої інтенсивність поділу клітин різко знижується. Під час п'ятої фази - стаціонарної - маса калусу не збільшується, оскільки відмирання клітин, що почалося, ще компенсується за рахунок їх ділення. Далі наступає відмирання калусу.

Культивовані калусні клітини і тканини зберігають багато фізіологічних особливостей, властивих клітинам рослини, з якої вони були отримані. Зберігаються, наприклад, такі властивості, як морозостійкість, стійкість до абіотичних чинників (температура, засолення, фотоперіодична реакція), а головне, хоча і різною мірою, здібність до синтезу вторинних метаболітів. Разом із загальними у калусних клітин з'являються свої, характерні тільки для них особливості. Наприклад, при тривалому культивовані in vitro клітини вищих рослин, як калусні, так і суспензійні, утворюють специфічну популяцію, що відноситься до типу нестатевих, тобто популяцію соматичних клітин. Найбільш характерні властивості цієї популяції - фізіологічна асинхронність і генетична гетерогенність.

Фізіологічна асинхронность - полягає в тому, що в кожен даний момент часу клітини знаходяться в різних фазах росту: одні діляться, інші ростуть, а треті вже старіють. Тому загальний фізіологічний стан такої популяції прийнято оцінювати за станом більшості клітин. Асинхронність - стійка властивість популяції калусних клітин. Якщо за допомогою специфічних дій синхронізувати проліферацію клітин популяції, то вже через 3-4 ділення вона знов стає асинхронною.

Причини виникнення асинхронності дуже різноманітні:

1. Особливості виду, сорту, генотипу індивідуальної рослини, а також особливості експланта.

2. Стреси при культивуванні, наприклад неоптимальний склад живильного середовища для даного виду клітин.

3. Зміна балансу ендогенних гормонів і концентрації в середовищі екзогенних гормонів протягом вирощування.

4. Генетична гетерогенність клітин і клонів.

5. Аномалія мітотичного циклу клітин in vitro.

6. Фізичні чинники (температура, світло, аерація).

Генетична гетерогенність - властивість клітин соматичної популяції (нестабільність генома і їх генетична гетерогенність). Генетично стабільними вважаються тільки клітини меристематичних тканин. У клітинах решти тканин при культивуванні можуть виникати поліплоїдія, анеуплоїдія, хромосомна аберація, генні мутації. Проте генетичну гетерогенність не можна розглядати як недолік, оскільки вона є необхідною умовою існування популяції клітин і служить основою для їх адаптації.

Як причини появи генетичної гетерогенності можна назвати наступні:

1. Генетична гетерогенність початкового матеріалу. У рослинах клітини характеризуються різною плоїдністю, диплоїдні тільки меристематичні клітини, що активно діляться.

2. Порушення корелятивних зв'язків при виділенні первинного експланта з рослини.

3. Дія компонентів середовища. Екзогенні гормони і стимулятори можуть проявляти мутагенну дію. Ауксини, особливо 2,4-d, що входять до складу поживних середовищ, - мутагени; цитокініни сприяють поліплоїдизації клітин.

4. Тривале субкультивування, при якому накопичуються генетично змінені калусні клітини.

Після 5-6 пересадок новий каріотип клітинної популяції, як правило, стабілізується, якщо умови культивування залишаються постійними. Інакше зміна фізичних або трофічних чинників приведе до нових генетичних змін.

Генетична нестабільність калусних клітин має велике значення для селекційної роботи, оскільки дозволяє відбирати штами клітин із зміненим генотипом. Ці клітини можуть володіти унікальними властивостями: підвищеною стійкістю до несприятливих чинників, підвищеною продуктивністю і так далі. Проте генетична гетерогенність популяцій калусних клітин в культурі не впливає на збереження в їх геномі основних якостей виду і рослини-донора.

Гормонезалежність. Хоча гормони і викликають мутації, калусні тканини більшості рослин утворюються тільки в присутності в поживному середовищі і ауксинов, і цитокінінів. Виняток становлять, наприклад, незрілі зародки пшениці і сім'ядолі соняшника. Перші утворюють калусную тканину на поживному середовищі з 2,4-d, але без цитокінінів. Другі, навпаки, - на середовищі, що містить цитокініни,але без ауксинів.

При тривалому культивуванні практично у всіх тканин може виникати специфічна властивість гормонезалежності, тобто автономності по відношенню до ауксинів і цитокінінів. Ці тканини можуть рости на середовищі без гормонів, що робить їх схожими на пухлинні клітини і різко відрізняє від нормальних калусних тканин. Зовні ж такі гормонезалежні тканини нічим не відрізняються від калусних. Клітини, які в процесі культивування набули властивість автономності від присутності в середовищі гормонів, називаються «звиклими». Тканини, утворені такими «звиклими» клітинами, називають «хімічними пухлинами» на відмінність від рослинних або генетичних пухлин. Генетичні пухлини виникають на міжвидових гібридах рослин. Рослинні пухлини мають бактеріальне або вірусне походження. Найчастіше рослинні пухлини виникають при попаданні в рослини агробактерій. Так, Agrobactehum tumefaciens викликає утворення корончатих галлів, A. rhizodenes - бородатого кореня, А. гии - стеблового галла. Перетворення рослинних клітин на пухлинні пов'язане з проникненням в них ДНК бактеріальної клітини, так званої ti-плазміди, яка значно змінює властивості клітини, зокрема експресирує гени, контролюючі синтез ауксинів і цитокінінів. Гормоннезалежність «звиклих» клітин пов'язана із зміною активності власних генів, відповідальних за синтез білків-ферментів, що беруть участь в синтезі гормонів. Таким чином, «звиклим» тканинам і рослинним пухлинам в рівній мірі властива гормоннезалежність, але у рослинних пухлин вона носить генетичний характер. У «звиклих» клітин ця властивість досягається головним чином за рахунок епігеномних змін. Існує ще одна особливість, що дозволяє відрізнити «звиклі» і пухлинні клітини від звичайних калусних. Зазвичай ні пухлинні, ні «звиклі» тканини не здібні до нормальної регенерації. Вони можуть утворювати потворні органоподобниє структури, так звані тератоми. В окремих випадках у тривало культивованих тканин вдається відсунути поріг «звикання» завдяки зміні складу поживних середовищ і добитися регенерації нормальної рослини.