Виробництво рекомбінантних фармацевтичних білків трансгенними рослинами -«молекулярне фермерство»

Виробництво фармацевтичних білків, антитіл, вакцин на основі генноінженерних підходів є яскравим прикладом тих переваг, які надає сучасна біотехнологія рослин. Такі білки та пептиди називаються рекомбінантними, тому що їх отримують з використанням технології рекомбінантних ДНК. Очевидно, першим практичним результатом в цій галузі слід вважати патент фірми «Сalgnе» на експресію інтерферону миші в клітинах рослин. Пізніше була встановлена можливість синтезу імуноглобулінів у листках трансгенних рослин, інших білків людини і тварин.

Рослина як природний біореактор з виробництва рекомбінантних білків має певні переваги порівняно із клітинами тварин, людини та мікроорганізмів:

• рекомбінантні білки, синтезовані в рослині, не потрібно піддавати денатурації та ресинтезу;

• рослини здатні не лише до синтезу і збирання, а й до глікозилювання білків тварин; це абсолютно необхідно для синтезу антитіл і деяких інших функ­ціонально повноцінних білків;

• рослини порівняно із клітинами ссавців і трансгенними тваринами, забезпечують значне здешевлення виробництва рекомбінантних білків, причому без обмежень, пов'язаних зі зростання обсягів такого виробництва; наприклад, якщо середня вартість очищених пептидів, отриманих за допомогою інших сучасних методів, становить 100 тис. — 1 млн дол. США за 1 кг, то їх вартість у разі отримання із трансгенних рослин дорівнює 1 тис. дол. США за 1 кг;

• у препаратах, отриманих із рослин, порівняно з препаратами тваринного чи мікробіологічного походження значно менше або й зовсім відсутні небажані віруси та пріони; відсутні домішки, що мають алергічну, імуносупре-сивну, канцерогенну, тератогенну дію на організм людини; це зумовлює порівняну легкість очищення синтезованих рослинами фармацевтичних пептидів;

• під час вживання сирих овочів і фруктів, що містять гени, які кодують синтез білків—вакцин, відбувається імунізація організму.

Існує кілька підходів у індукції синтезу рекомбінантних білків у рослинах, основними з яких є:

• отримання трансгенних рослин із вбудованими генами рекомбінантних білків; такі рослини, представники різних видів, що несуть різноманітні гени синтезу рекомбінантних білків, вже отримані, деякі з них випробовують для комерційного використання; недоліком цього підходу є відносно невисока концентрація рекомбінантного білка, що зменшує можливість використання таких рослин для виробництва очищених препаратів; тому ця технологія застосовується для виробництва їстівних вакцин або інших білків, які можуть споживатись в неочищеному стані; модифікації, що ґрунтуються на можливості як спонтанної, так і індукованої секреції (ексудації) рекомбінантних білків у живильне середовище у разі вирощування трансгенних рослин в умовах гідропоніки, застосовуються для отримання очищених препаратів рекомбінантних білків; наприклад, у рослини тютюну трансформована кодуюча послідовність лужної фосфатази людини (SЕАР) під промотором манопінсинтази, який експресується у коренях; під час культивування коренів трансгенних рослин у рідкому середовищі основним компонентом ексудату коренів є рекомбінантний білок SЕАР

• використання трансформації хлоропластів; цей метод дає змогу різко збільшувати кількість потрібного білка в листках транспластомних рослин; так, накопичення соматотропіну людини (гормон росту), ген якого було внесено в хлоропласти тютюну, становило до 7 % усього розчинного білка транспластомної рослини; в окремих випадках рівень рекомбінантного білка може навіть досягати 47 % сумарного розчинного білка; проте широке застосування цієї технології поки що стримується труднощами трансформації хлоропластів;

• використання позаклітинних генетичних елементів; перші подібні генетичні конструкції були створені на базі РНК-вмісного вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ); ген біосинтезу цільового білка клонують під контролем промотору вірусу (звичайно використовують субгеномний промотор білка оболонки вірусу) в бактеріальному векторі, який містить повну кДНК копію вірусної РНК; потім у безклітинній системі на основі отриманого вектора синтезується вірусна РНК, яка наноситься на пошкоджені листки тютюну або споріднених видів; протягом 1—2 тижнів відбувається накопичення вірусних часточок, що містять рекомбінантний білок; така система дає змогу за короткий термін накопичувати значну кількість цільового білка в листках інфікованої рослини (2—10 %, іноді до 20 % загальної кількості рослинного білка); з використанням цього підходу в США розроблено метод лікування одного з типів лімфом (неходжківської лімфоми); причина цієї хвороби полягає в активному розмноженні В-лімфоцитів, причому у кожного пацієнта розмножується індивідуальний клон лімфоцитів, що несуть на своїй поверхні специфічні антитіла; специфічність антитіл визначається сайтом зв'язування, одночасно ця сама ділянка слугує антигеном для синтезу антитіл проти себе; сутність лікувального підходу полягає в тому, що у пацієнта індукується синтез своїх антитіл, специфічних до сайту зв'язування антитіл клону В-лімфоцитів, що злоякісно розмножуються; за класичного лікарського підходу на основі В-лімфоцитів пацієнта отримують гібридоми, які продукують такі специфічні антитіла, а вже на їх основі готують ад'юванти (стимулятори імуногенезу) для вакцинації пацієнтів; проте отримання гібридом і накопичення достатньої кількості антитіл потребує багато часу і коштів, оскільки така технологія застосовується індивідуально для кожного пацієнта.

Новий підхід ґрунтується на клонуванні послідовності ДНК, що відповідає сайту специфічності антитіл лімфоцитів, потім створюється вірусний вектор, яким інфікуються рослини будь-якого виду тютюну. В листках таких рослин швидко накопичується відповідний рекомбінантний білок. Цей метод дає змогу вже через 2—3 тижні отримати необхідну індивідуальну вакцину для лікування пацієнта. На сьогодні завершуються клінічні випробування таких вакцин.

Системи швидкого перепрограмування рослин постійно удосконалюються. Наприклад, внесення генетичного матеріалу в рослини можна здійснювати шляхом агробактеріальної інфільтрації. У цьому випадку генетичний матеріал попадає в клітину після ін'єкції в листки рослини агробактерій, які містять відповідний вектор. Агробактерії переносять свою тДНК в клітини мезофілу листка. У тДНК агробактерій вбудована кДНК, отримана на основі необхідних для утворення і проліферації вірусу ділянок вірусної РНК, а також ген (гени) рекомбінантного білка. В рослинних клітинах утворюється РНК після зчитування тДНК. Далі відбувається процес, аналогічний зараженню вірусними РНК. Такий підхід дає змогу обходитись без синтезу РНК у безклітинній системі, а також використовувати не лише цілісні, але й розділені ділянки генів, які клоновано в різні штами бактерій. Ці гени остаточно збираються всередині рослинної клітини після одночасної інфільтрації цими штамами агробактерії.

На основі описаних технологій створені трансгенні рослини, які використо­вують для виробництва оральних вакцин, що має велике економічне значення, особливо для країн, що розвиваються, у зв'язку із значним здешевленням їх отримання і відсутністю потреби очищення у випадках перенесення відповідних генів у фрукти і овочі, що вживаються у сирому вигляді.

До білків широкого використання, які внаслідок низького рівня синтезу в специфічних тканинах чи продуктах є рідкісними, належить лактоферин, що знаходиться в невеликій кількості у молоці ссавців, лейкоцитах крові. Лактоферин людини (hlf) перспективно використовувати як харчову добавку і ліку­вальний препарат для профілактики і лікування інфекційних захворювань шлунково-кишкового тракту дітей раннього віку, підвищення імунної відповіді організму в разі злоякісних і вірусних (СНІД) захворювань. Отримання лакто-ферину з молока великої рогатої худоби внаслідок його низького вмісту призводить до високої вартості препарату. Під час введення кДНК гена лакто-ферину в клітини тютюну отримано ряд калюсних тканин, що синтезують вкорочений лактоферин, антибактеріальні властивості якого значно сильніші за антибактеріальні властивості нативного лактоферину. Концентрація цього вкороченого лактоферину в клітинах тютюну досягає 0,6—2,5 %.

За допомогою агробактеріальної трансформації отримано трансгенні рослини тютюну, що несуть ген білка оболонки вірусу лихоманки свиней, трансгенні рослини і калюсні тканини тютюну, що експресують білки вірусу гепатиту Б. Під час годування мишей цими трансгенними рослинними продуктами у них був ідентифікований синтез специфічних антитіл.

Гени великого і середнього антигену білка оболонки вірусу гепатиту Б, білка G кроля, епідермального фактора росту людини і кальцитоніну людини експресовані у рослинах картоплі. Рівень експресії інтродукованих генів дорівнює від 20 до 90 нг/мг розчинного білка залежно від генетичної конструкції й типу тканини рослин. Імуногенні властивості білків середнього антигену нижче від більшого антигену рослини і вакцини. Показано, що ізольований із рослин білок середнього антигену може бути використаний для оральної імунізації.

Доведена можливість збирання повного тетрамерного імуноглобуліну в трансгенних рослинах. Рекомбінантний імуноглобулін зберігає нативну конформацію. Під час вирощування трансгенних клітин у суспензійній культурі полімерні імуноглобуліни виділяються в культуральне середовище.

Можливе отримання у трансгенних рослинах білків ссавців зі зміненими властивостями. У такий спосіб змінена структура важкого ланцюга антитіла ІgС1. Трансгенні рослини синтезують альбумін людини, моноклональні антитіла, вакцини, фітази, бактеріальну α-амілазу.

Трансгенні рослини (продуценти аутоантигенів) використовують у разі інших аутоімунних хвороб, таких, як множинний склероз, ревматичний артрит, інсулінзалежний діабет і навіть відторгнення під час трансплантації органів. Інсулінзалежний діабет є аутоімунним захворюванням, за якого клітини підшлункової залози, що продукують інсулін, руйнуються власними Т-лімфоцитами. Оральне вживання значної кількості імуногенних білків може привести до запобігання і значного затримання проявів симптомів аутоімунних хвороб. Білки інсулін і панкреатична декарбоксилаза глютамінової кислоти розглядаються як оральні вакцини для запобігання інсулінзалежного діабету. Канадськими біотехнологами отримано трансгенні рослини картоплі, що синте­зують панкреатичну декарбоксилазу глютамінової кислоти. В разі годування такою картоплею схильних до діабету мишей відмічено зменшення як випадків діабету, так і величини аутоімунної відповіді.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений // Рост растений и природные регуляторы – М.: Наука, 1977.

2. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука, 1986.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.

4. Гамбург К.3., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тка-ней и клеток растений – Новосибирск: Наука, 1990.

5. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений – Киев: Наукова думка, 1984.

6. Калинии Ф.Л., Бутенко Р.Г. Методы культуры тканей в физиологии рас-тений – Киев: Наукова думка, 1980.

7. Калинин Ф.Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В.В. Технология микрокло-нального размножения растений – Киев: Наукова думка, 1992.

8. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М.: Наука, 1983.

9. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин // Биортехнология. Т. З. – М.: Высшая школа, 1987.

10. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии: Методические указания / Сост. Г.М. Артамонова, С.И. Герасимова, С.В. Дегтярев, Е.З. Кочиева, Д.В. Калашников, И.К. Блиновский, Л.И. Хрусталева. Под ред. акад. ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи. Москва: Изд-во МСХА, 1991.

11. Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодо-водстве и цветоводстве / Сб. науч. трудов ВНИИГиСП – Мичуринск, 1989.

12. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Порофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологий. – М: Наука, 1990.

80