Афінна хроматографія.

Цікавим хроматографічним методом є афінна хроматографія, заснована на нативній специфічності деяких біополімерів, особливо якщо вони містяться в культуральній рідині в невеликих концентраціях – менше

1 мкг/мл. В цьому методі гарний поділ досягається за рахунок специфічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною.

Між афінною хроматографією й іншими більш традиційними методами адсорбційної чи іонообмінної хроматографії існують значні розходження. У традиційних хроматографічних методах спочатку адсорбуються всі компоненти суміші, а їхній поділ здійснюється на стадії десорбції за допомогою, наприклад, заміни концентрації елюенту, чи концентрації солей у елюенті, чи поступового підвищення рН елюента. Навпаки, специфічність афінної хроматографії визначається в основному на стадії сорбції (рис. 3). Тому в афінній хроматографії через стовпчик доцільно пропускати розчин поділюваної суміші протягом досить тривалого проміжку часу, поки не буде досягнуто насичення нерухомої фази, тому що в ній адсорбуються практично тільки виділені з'єднання. Таким чином, проведення поділу БАР в афінній хроматографії наближається до звичайної сорбції в нерухомому шарі аж до насичення шару адсорбенту і різко відрізняється від звичайного поділу багатокомпонентної суміші, що вводиться в стовпчик однократно у вигляді концентрованого розчину.

Рис. 3. Схематичне представлення афінної хроматографії:

а - уведення суміші речовин; б - розділення; в - елюювання зв’язаного з нерухомою фазою компонента суміші

В цьому методі гарний поділ досягається за рахунок специфічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною. Показані три стадії: введення суміші речовин а, поділ б; елюювання, пов'язане з нерухомою фазою компонента суміші в.

Сорбенти для афінної хроматографії.

Сорбентами для афінної хроматографії в основному є полімери, які використовуються для гельпроникаючої хроматографії, після цілеспрямованої модифікації (агарози, поліакриламіди, целюлози, пористе скло).

Найважливіший параметр при модифікації вихідних матриць є об'ємна концентрація, що відповідає угрупованню, яка, як правило, вибирається емпірично. Другий найважливіший параметр - стабільність нанесеного афінату в процесі сорбції - елюації. Якщо афінатами є білки, наприклад, поліклональні чи моноклональні антитіла, білкові і пептидні інгібітори, то стабільність шару афінату можна підвищити, проводячи додаткову міжмолекулярну зшивку. Концентрацію зливаючого агента (наприклад, глутарового альдегіду) потрібно вибирати з урахуванням необхідності уникнути істотної зміни конформації зшитих білків, що часто приводить до втрати афінату.

При виборі вихідного сорбенту приходиться приділяти увагу скороченню розмірів доступних областей у порах після введення в них протяжних афінатів. Тому матриці для біоспецифічної хроматографії з об’ємними афінатами повинні мати діаметри пор, які перевищують в 3-5 разів суму хроматографічних діаметрів макромолекул комплексів антиген-антитіло, білок-інгібітор і т.д..

При використанні білків у якості афінатів потрібно враховувати гетерогенність сорбційних центрів, обумовлену такими факторами, як гетерогенність білків до приєднання (вплив протеаз і денатурації, зміна структури і властивостей афінатів у процесі приєднання), а також у процесі поділу. Цей фактор виявляється особливо суттэвим з точки зору впливу навантаження на стовпчик як при сорбції, так і при виборі умов десорбції.

Сутність методу біоспецифічної хроматографії полягає в тому, що між одним або обмеженим числом білків-ферментів з безлічі наявних у фракційній суміші і полімерним сорбентом утворюється досить стабільний зв'язок, у результаті чого ці білки з розчину переходять на нерозчинний сорбент, що підвищує його селективність.

Висока селективність біоспецифічних сорбентів забезпечується тим, що в якості лігандів використовуються речовини, специфічно взаємодіючі з активним центром виділюваного ферменту. Центром зв’язування служать приєднувальні до полімерним матриць субстрати, їхні аналоги, оборотні інгібітори, коферментн, антитіла й інші речовини, звичайно названі лігандами.

Таблиця 3.

Очищені препарати	Ліганди
Ферменти	Субстратний аналог, інгібітор, антиген, вірус, антитіла
Гормони, вітаміни	Рецептор, білок-переносник

Другим компонентом біоспецифічного сорбенту є полімерна матриця, до якої приєднується ліганд. Матрицею може бути будь-який полімер, у тій чи іншій мірі задовільнячи наступні вимоги:

- великопористість гелевої структури;

- гідрофільність, що забезпечує гарну взаємодію її з водою і відсутність неспецифічного зв’язування білків по гідрофобних центрах;

- відсутність у структурі зарядженних груп;

- здатність полімеру легко активуватися визнвченими хімічними агентами.

Вказаним вимогам відповідають: синтетичні полімери -поліакриламіди, сферони, а також великопористе скло і силікагелі.

Зазвичай хроматографічний процес складається з послідовно мінливих етапів сорбції, видалення несорбованих білків і елюациї сорбованих ферментів.

Великі перспективи відкриває використання моноклональних антитіл для приготування афінних гелів. Досить 4,0-5,0 антитіл, щоб приготувати 1 л афінного гелю. Такі гелі успішно застосовують для виділення із середовища культивування тваринних клітин, наприклад, гормону росту людини - самототропину й інтерферону.

Направлений синтез біоспецифічних сорбентів і вибір режимів афінної хроматографії дозволяє домогтися таких високих ступенів очищення БАР, які недоступні для інших хроматографічних прийомів. За одну стадію ступінь очищення може досягати 10²-10³ разів.

По своїй природі афінна хроматографія є варіантом адсорбційної хроматографії і її основні закономірності близькі оберненофазній і іншим видам адсорбційної хроматографії. Використовуючи рівняння

,

можна показати, що втримання БАР відбувається тільки за умови , коли концентрація іммобілізованого афінату більше константи дисоціації комплексу фермент-афінат, наприклад, відносне утримання при = 1 моль/л можливе при величині константи дисоціації моль/л. Очевидно, що при використанні афінатів з більшою величиною необхідно підвищувати концентрацію іммобілізованого афінату. Навпаки, при використанні афінатів з дуже малими величинами можна одержати ефективно утримуючі сорбенти навіть при невеликих концентраціях афінатів.