Етапи розвитку методу культури клітин, тканин і органів рослин

1892 - 1902 р

німецькі вчені X. Фехтінг (І. Vochting, 1892), К. Рехінгер (З, Rechinger, 1893), Г. Габерландт (G. Haberlandt, 1902) намагалися вирощувати ізольовані з рослин шматочки тканин, групи клітин, волоски. Тривало ростучих in vitro культур вони не отримали. Проте Рехінгер спостерігав процес утворення калуса сегментами стебла тополі, кореня кульбаби та інших і визначив мінімальний розмір фрагмента, здатного утворити калус. Не досягнувши експериментальних успіхів, ці перші дослідники висловили ряд ідей та гіпотез, реалізованих значно пізніше. Фехтінг вважав, що полярність властива не тільки органам рослини, але і окремій клітині. Габерландт висунув гіпотезу про тотипотентність будь-якої живої клітини рослини.

1902 по 1922 р.

не приніс успіхів ботанікам, що працювали над створенням оптимальних живильних середовищ, здатних забезпечити існування і тривале розмноження in vitro ізольованних тканин і клітин рослин. Були отримані перші результати по культивуванню тканин тварин на живильних середовищах з додаванням сироваток. Проте спроби ботаніків виростити ізольовані тканини рослин на середовищах з додаванням екстрактів рослинної тканинини (по аналогії із застосуванням сироваток крові і ембріональної для клітин тварин) були невдалі.

1922 р.

Роббінс і незалежно від нього Котте показали можливість культивування на синтетичному живильному середовищі меристеми кінчика кореня томатів і кукурудзи. Ці досліди можна вважати за початок застосування методу культури ізольованих органів рослин.

1932-1939 рр

вдосконалення методу культури тканин і клітин вищих рослин, що почалося з робіт американського дослідника Ф.Уайта і французького Р. Готре (1932-1934). Обидва вони повторили досвід Роббінса і Котте, показавши, що ізольоване коріння може рости в культурі необмежено довго, якщо їх кінчики періодично пересаджувати на свіже живильне середовище. Здатність до необмеженого росту при субкультивуванні була продемонстрована пізніше цими авторами для калусних тканин камбіального і паренхімного походження (R. Gautheret, 1934), а також для тканин рослинних пухлин (Р. White, 1939).

1940-1960 рр.

В цей період збільшилося число видів використовуваних рослин, тканини яких вирощували in vitro. Вперше культуру тканин лікарської рослини отримав Ф. Уайт у 1945 р. від корончастого галу барвінку рожевого Vinca rosea, а в 1947 р. Р. Готре із співробітниками одержав культуру тканин блекоти чорної Hyosciamus niger і показав її здатність синтезувати відповідні алкалоїди. Список, приведений в монографії Р. Готре (R. Gautheret, 1959), включав вже 142 види. Тривалі пересадкові культури успішно отримували з різних органів і тканин рослини. Були розроблені склади живильних середовищ, вивчено значення макро- і мікроелементів для підтримки нормальної ростової активності тканини. Виявлена потреба культур у вітамінах і стимуляторах росту. Оцінено значення натуральних екстрактів типу ендосперма кокосового горіха, каштана, кукурудзи та інших рослин для підтримки неорганізованого клітинного росту і стимуляції процесів органогенезу і соматичного ембріогенезу в культурі калусних тканин і клітинних суспензій. У роботі з культурою тканин відкритий новий клас фітогормонів (цитокініни) і показано значення кінетину та інших N-6-замещених амінопуринів для проліферації клітин in vitro та індукції стеблового морфогенезу (R. Heller, 1953; Z. Kulescha, 1954; I. Nitsch, 1955; C.Miller, F. Skoog, 1955; F. Steward, 1958, P. Р. Бутенко, 1958).

Розроблений метод отримання і вирощування великих мас клітинних суспензій (L. Nickell, W. Tulecke, 1959), а також метод культивування окремої, відділеної з суспензії клітини, ділення якої індукується за допомогою тканини-няньки (L. Jones et al.. 1960; М. К- Павлова, Р. Р. Бутенко, 1965).

1960-1975 рр.

запропонований метод отримання ізольованих протопластів з тканин кореня і плодів томатів шляхом обробки їх сумішшю пектолітичних і целюлітичних ферментів (Е. Cocking, 1960). Знайдено умови культивування ізольованих протопластів, при яких вони утворюють нову клетинну стінку, діляться і дають початок клітинним лініям, здатним у ряді випадків до морфогенезу (I. Такеbе et al., 1971). Разом, з тим ізольовані протопласти, що ще не утворили клітинну стінку, були використані для розробки методів гібридизації соматичних клітин шляхом злиття протопластів за допомогою поліетиленгліколя (ПЕГ) і введення в них вірусних РНК, клітинних органел, клітин бактерій. Перші соматичні гібриди послужили моделями для вивчення поведінки ядерного і цитоплазматичного геномів партнерів в гібридних клітинних лініях і в потомстві соматичних гібридів рослин, що регенерували з гібридних клітин (Р.Р. Бутенко, 1979, Ю.Ю. Гліба, 1980). Розроблений метод культури меристем, що дозволяє отримувати тестовані на відсутність вірусів та інших патогенів рослини. За допомогою цього ж методу безвірусні рослини з високим коефіцієнтом розмножуються. Метод широко використовується для отримання оздоровленого посадочного матеріалу багатьох економічно важливих рослин.

Продовжується розробка методів і апаратури для глибинного культивування клітин.

Вперше отримані і вивчені рослини-регенеранти тютюну, що являють собою сомаклональні варіанти початкової форми (Н.Загорська та ін., 1967).

На початку 70-х років XX ст. стало зрозуміло, що культивовані іп vitrо клітини вищих рослин можна використовувати у виробництві як джерело цінних алкалоїдів, ферментів, глікозидів, ефірних олій, що призвело до появи перших патентів в галузі розробки біореакторів (ферментерів) з метою отримання великих кількостей клітинної біомаси. Серед перших таких робіт слід назвати метод вирощування клітин в рідкому середовищі в культуральних посудинах місткістю 20; 30 і 135 л (дм³), перемішування та аерація в яких відбувається продуванням середовища стерильним повітрям. У 1976 р. японські дослідники в результаті великомасштабного культивування отримали біомасу клітин тютюну об'ємом 20 м³.

Першою промисловою клітинною біотехнологією лікарських рослин стало одержання біомаси калусної культури тканин женьшеню, розпочате на заводах СРСР у 1972 р. Промисловий штам калюсної культури женьшеню БИО-2 був створений на основі калюсу, одержаного Р.Г. Бутенко у 1960 р. Детальне фармакологічне вивчення клітинної біомаси женьшеню, проведене Л.І. Слепян у 60-х роках в Ленінградському хіміко-фармацевтичному інституті, оптимізація умов вирощування та складу живильного середовища, проведені Н.Ф. Пісецькою, розробка технології великомасштабного вирощування біомаси, виконана І.В. Александровою у Всесоюзному НДІ «Біотехніка», завершилась створенням промислового регламенту, широко впровадженого в 70-х роках на заводах Головмікробіопрому СРСР. У 1991 р. клітинну біомасу женьшеню одержували на 15 заводах (в тому числі на чотирьох заводах в Україні) щорічно, починаючи з 1988 р., понад 2500 кг в перерахунку на суху біомасу. В ці роки на світовому ринку вартість сухого кореня дикорослого женьшеню була в межах 200—300 тис. дол. США, плантаційного - 20—30 тис. дол. США, ціна 1 кг сухої біомаси культурального женьшеню на внутрішньому ринку СРСР була приблизно 1500 дол. США (в межах 1300—1500 руб.). Це дало змогу застосовувати екстракт клітинної біомаси женьшеню не лише для випуску лікарського препарату «Біоженьшень» (з 1989 р.), а й, починаючи з 1972 р., випускати широкий спектр косметичних і харчових товарів, зокрема напоїв, з добавками такого екстракту. Наприкінці 80-х років в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України створено новий клітинний штам женьшеню, БІО-2МК, який накопичує тритерпенових глікозидів у декілька разів більше, ніж штам БІО-2 (рис.1), він успішно використовувався як лікарська сировина.

З кінця 70-х років в СРСР, в тому числі на двох заводах України, впроваджена технологія одержання клітинної біомаси родіоли рожевої. Ця технологія розроблена у Всесоюзному НДІ «Біотехнологія» на основі клітинного штаму, одержаного І.В. Александровою і А.Н. Даніліною, схарактеризованого і паспортизованого в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України (В.А. Кунах, О.І. Свідченко). Клітинну біомасу родіоли використовували головним чином в парфумерному та косметичному виробництвах.

1976-1985 рр.

розроблені метод електрозлиття ізольованих протопластів (U. Zimmerman, 1983) і методи селекції гібридних клітин. З використанням ізольованих протопластів і векторів, створених на основі Тi-плазміди Agrobacterium tumefaciens, створений ефективний спосіб перенесення генів для дводольних рослин.

Методи мутагенезу і клітинної селекції, отримання сомаклональних варіантів і експериментальних гаплоїдів застосовуються для створення нових форм і сортів сільськогосподарських рослин.

Методи скринінгу біохімічних мутантів привели до появи продуктивніших і пристосованих до умов культивування клітинних штамів, використовуваних в промисловості. Виникли методи іммобілізациі культивованих кліток з метою біотрансформації хімічних сполук.

В Японії у 1983 р. отримана перша промислова партія чистої речовини - нафтохінонового барвника шиконіну з біомаси культивованих клітин горобейника лікарського масою 40 кг для виготовлення губної помади найвищого гатунку. Другою в світі технологією отримання чистої речовини було виробництво в Україні з 1987 р. на Харківському виробничому хіміко-фармацевтичному об'єднанні «Здоров'я» алкалоїду аймаліну, що використовується для виготовлення протиаритмічних лікарських препаратів. Ця технологія розроблена на основі найпродуктивніших клітинних штамів К-20 та К-27, отриманих співробітниками Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (В.А. Кунах та ін.) та Ленінградського хіміко-фармацевтичного інституту (О. Г. Воллосович та ін.).