Глибинне суспензійне культивування

Для суспензійного культивування необхідно одержати лінії клітин, що утворять невеликі агрегати (по 5-10 клітин) Для цього більш придатні пухкі калусні тканини. Трансплантант бажано обробляти пектиназою. Рекомендується використовувати середовища, що містять 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту і не містять іони Са. У таких середовищах агрегати клітин не утворюються. Перед пересіванням первинну культуру фільтрують через два шари марлі або через сита (нейлонові, металеві), щоб відокремити великі агрегати калусної тканини й залишки трансплантанта. На утворення клітинних агрегатів також впливає інтенсивність перемішування середовища, тому що клітини надзвичайно чутливі й швидко лізуються. Більшість клітин гине.

Глибинне культивування можна здійснювати в колбах на кочалках при частоті обертання 100-120 об/хв.

На 60-100 мл середовища беруть 2-3 мл свіжої калусної тканини. Для культивування рослинних клітин використовують також спеціальні металеві або скляні ферментатори різної конструкції (з мішалками або барботажного типу). Режим ферментації періодичний або безперервний, головним чином хемостатний.

Біосинтез проводять в апараті об’ємом від 0,1 до 63м^3.і більше (мал. 9.2).

При керуванні процесом вирощування клітин важливо мати гомогенну систему.

Аерацію культуральної біомаси здійснюють стерильним повітрям через барботер. Повітря стерилізують, як правило, шляхом фільтрації на двох-трьох послідовно встановлених фільтрах. У ході культивування клітин рослин регулюють температуру (25-37 ⁰С), рН і окислювально-відновний потенціал.

Процес культивування ведуть доти, поки йде інтенсивний синтез цільового продукту й поки в середовищі не будуть вичерпані поживні речовини. При визначенні кінця культивування необхідно враховувати дані мікроскопічного контролю стану культури, відсутність сторонньої мікрофлори, концентрацію основних поживних речовин, біомаси, цільового продукту, рН.

Рис. 2. Схема ферментатора з комбінованим підведенням енергії для глибинного культивування

1 - вал; 2, 3, 6 - мішалки; 4 - статор; 5 - барботер

Необхідно відзначити, що рослинні клітини ростуть і розмножуються значно повільніше, ніж клітини мікроорганізмів. Час їхнього подвоєння 1-3 доби. Процес культивування рослинних клітин займає 2-3 тижні, що підвищує вимоги до забезпечення асептичних умов.

У наш час методом культивування клітин у промислових умовах одержують речовини вторинного метаболізму. Практичний інтерес представляють алкалоїди, глікозиди, полісахариди, терпеноїди, поліфеноли, ефірні масла, пігменти й ін. Деякі вторинні метаболіти, одержувані при культивуванні рослинних клітин перераховані в табл. 9.3.

Таблиця 9.3

Продукти вторинного метаболізму, одержані при культивуванні

рослинних клітин

Продукт	Застосування
Вінбластин або вінкристин	Лікування лейкемії
Дигітин	Лікування серцево-судинних захворювань
Хінін	Лікування малярії
Кодеїн	Аналептик
Аймалін	Противоаритмічний

Як у будь-якому біотехнологічному процесі при одержанні метаболітів за допомогою клітин рослинного походження, важливе значення має активність продуцента. Останні досягнення клітинної інженерії показали, що в ряді випадків метаболіти, які активно продукують рослинні клітини, можна одержати методом злиття протопластів двох вихідних рослинних клітин. При цьому гібридні клітини продукують не тільки метаболіти вихідних рослин, але й зовсім інші. Гібридизацію рослинних протопластів успішно здійснюють методом електростимуляції злиття клітин або прямим мікроіньєкціонуваням ДНК однієї клітини в іншу. Ямомото одержав таким чином гібридні клітини з Coptus japonica (копті японська) й Euphorbia millii молочай Міля (терновий вінець), які активно продукують алкалоїд берберин - антибактеріальні й протитифозні речовини. Концентрація берберину в культуральній рідині досягає 1,39 г/л.