Методи підвищення продуктивності культур тканин продуцентів бар

Для підвищення продуктивності культивованих клітин широко і в багатьох випадках успішно застосовують:

• клітинну селекцію, що ґрунтується як на спонтанній, так і на індукованій різними мутагенами мінливості культивованих клітин;

• оптимізацію умов вирощування і складів ростових і продукційних живильних середовищ;

• культивування диференційованих культур, клітин чи індукцію диференціювання; використання еліситорів.

Останнім часом з цією метою застосовують методи генетичної інженерії. Найрезультативнішим є трансформація клітин за допомогою бактерії Аgrоbасtеrіит rhіzоgепеs і отримання так званих бородатих коренів (hairy roots), про­дуктивність яких значно вища, ніж звичайних недиференційованих культур. Підвищують синтез вторинних метаболітів шляхом підсилення активності відповідного ферменту. Це можливо:

• шляхом введення гетерологічного гена з тією самою функцією від мікроорганізмів чи інших видів рослин;

• підстановкою власного гена під сильніший промотор;

• введенням гена, що кодує ферменти, нечутливі до ретроінгібування, чи гена, що кодує антитіла проти ензиму, що є конкурентом за той же субстрат, що і бажаний ген;

• зниження катаболізму цільових вторинних сполук.

Низький рівень біосинтезу вторинних метаболітів в культивованих клітинах зумовив пошук як спонтанних мутацій з підвищеним рівнем біосинтезу цільової речовини, так і застосування методів експериментального мутагенезу. Одними з перших були дослідження здатності культивованих клітин моркви накопичувати каротиноїди, виділено мутантні клітинні клони, що характеризуються пригніченням синтезу хлорофілу і значним підвищенням рівня синтезу каротиноїдів. Зокрема, візуально виділено мутантний клон жовтогарячого кольору який на відміну від звичайної тканини камбіального походження, що накопичує значну кількість хлорофілів а та b і невелику кількість каротинів продукує високий вміст каротинів і ксантофілу і майже повністю позбавлений хлорофілу.

Серед перших робіт із застосуванням мутагенів для отримання більш продуктивних клітинних ліній слід назвати вивчення впливу ультрафіолетового та видимого світла на ріст калюсу, отриманого з пилку гінкго, виділення антоціансинтезуючих клітинних ліній після обробки ультрафіолетом і X-променями, обробку калюсних тканин раувольфії зміїної азотистим іпритом.

Культивування продуктивних клітинних штамів

Калуси рослин і культури клітин культивують у стерильних умовах на спеціальних агаризованих або рідких живильних середовищах у суворо контрольованих умовах. Принциповий підхід полягає в можливості формування пер­винного калюсу, що започатковує суспензійно-клітинні культури. На цьому рівні звичайно проводять аналіз і добір високопродуктивних ліній клітин, що надалі проходять глибинне культивування у ферментерах. Аналіз культур слід проводити до 3-4-го пасажу. Залежно від культури тривалість одного пасажу може змінюватись від 15 до 45 діб.

Суспензійним культурам надається перевага внаслідок їх більшої морфологічної, біохімічної, генетичної вирівняності й прискореного росту. Час, потрібний для росту клітинної суспензії, дорівнює 14—20 діб. Добором швидкоростучих фракцій можна скоротити тривалість культивування до 8—12 діб.

Здатність синтезувати визначені вторинні продукти часто пов'язана з дифе­ренціюванням клітин. Наприклад, регенерація коренів є істотним під час виробництва ароматичних олій у культурах тканин цибулі, у той час як диференціювання бруньок бажане у разі біосинтезу дигітоксину.

Диференційовані культури тканин поділяють на культури коренів, бруньок, листків і соматичних зародків. Ступінь диференціації в цих групах змінюється від справжнього калюсу до формування цілого органа. Це означає, що конструювання нових біореакторів може виявитися вкрай потрібним для здійснення масштабного культивування і виробництва вторинних метаболітів із цілком або частково диференційованих тканин. У такому разі вважається, що витрати, пов'язані з одержанням продукту, можуть зменшитися за рахунок введення в техно­логічний процес дешевих вуглеводних джерел (наприклад, патоки), а також вуглекислого газу, індукції виділення продукту в середовище, напівстерильне вирощування і підвищення виходу продукту з використанням біокаталізу.

У визначенні продуктивності клітинних штамів, оптимізації їх росту і генетичної стабільності провідне місце належить живильним середовищам. їхніми найважливішими компонентами є фітогормони. Від балансу ауксинів і цитокінінів, що є основними фітогормональними компонентами, значною мірою залежить спроможність культур синтезувати цей метаболіт. Універсальних ре­цептів оптимізації середовища немає, але відомо що в багатьох культурах наявність 2,4-Д пригнічує вторинний метаболізм. Видалення або заміна її на інші ауксини або ауксиноподібні компоненти відновлює синтез вторинного метаболіту.

Не менш важливими елементами є вуглець, азот і фосфор. З усіх викорис­товуваних вуглеводних джерел, таких, як сахароза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, лактоза, рафіноза, сорбітол, крохмаль, сироватка, патока тощо, глюкоза і сахароза є найвживанішими субстратами, хоч у деяких випадках не найефективнішими.

З випробуваних джерел азоту, таких, як нітрати, сечовина, глутамін, гідролізат казеїну і суміш амінокислот, найприйнятнішими для культур клітин рослин виявилися нітратна й аміачна форми азоту. Фосфор звичайно використовують у формі дигідрофосфату калію (КН₂Р0₄).

Селекція високопродуктивних клітинних штамів

З метою підвищення продуктивності клітинних культур використовують різні методи селекції.

Ступінчаста селекція. Стабільні високопродуктивні клони одержують багатократним добором калюсних або суспензійних культур на спеціальних середовищах з поступовим збільшенням концентрації селективного фактора. Таким чином вдалось збільшити, наприклад, кількість аймаліну в клітинах раувольфії у 3—4 рази.

Одноклітинні клони. Застосовують мікробіологічні методи клонування з використанням суспензійних культур одноклітинного походження або культури протопластів. Цей прийом ґрунтується на поліморфізмі за спроможністю вихідних клітин синтезувати вторинні продукти. Міні-колонії, що відрізняються вищим накопиченням відповідного вторинного продукту, відбираються візуально, якщо продукт забарвлений (як у шиконіну) або методом ЕLISА, якщо продукт незабарвлений. Так, добором пігментних колоній горобинника червонокореневого отримано лінії із вмістом шиконіну в 25 разів більшим, ніж у вихідного штаму.

Клітинний мутагенез. Ступінь мінливості вихідних клітинних клонів за здатністю синтезувати вторинні біопродукти збільшують з використанням хімічних або фізичних мутагенів. У такий спосіб отримано високопродуктивні штами раувольфії зміїної, діоскореї, стефанії та інших культур.

Соматична гібридизація. Злиття протопластів передбачає нові можливості поліпшення і розширення спектра клітинних ліній, спроможних накопичувати кілька вторинних продуктів або продуктів, невідомих раніше. Це залежить від ядерно-цитоплазматичної взаємодії, що виникає лише під час соматичної гібридизації. Отже, дві лінії клітин, кожна з яких має високий рівень різноманітних ключових ферментів, можуть після злиття значно підвищити продуктивність.

Генетична інженерія. Це один із найефективніших методів одержання високопродуктивних клонів шляхом внесення у клітину чужорідної інформації.

Індукція вторинного метаболізму в культурі клітин рослин. Деякі мікроорганізми або продукти їх життєдіяльності під час спільного культивування з клітинами рослин стимулюють синтез вторинних метаболітів. Цей процес відомий як «еліситація» і є відповіддю рослинних клітин на спільне культивування, оскільки пошкодження рослин патогенами призводить до синтезу вторинних продуктів з антимікробними властивостями.

Кріоконсервування елітних клітинних ліній. З практичного погляду важливо, щоб високопродуктивні лінії клітин були збережені протягом тривалого часу без зміни їх здатності синтезувати вторинні продукти. Цього досягають методами кріозберігання. Високопродуктивні культури клітин зберігають синтезуючу здатність після кріогенного зберігання протягом кількох років. Цей метод особливо важливий для нестабільних ліній клітин, що у такий спосіб можуть періодично використовуватись з промисловою метою.