3.1.6. Генетическая модификация дрожжей

Применение методов генной инженерии позволяет для оптимизации штаммов дрожжей использовать наряду с селекцией и мутацией так называемое рекомбинирование. При мутации возможно изменение лишь отдельных генов, а при рекомбинировании удается соединить гены различных микроорганизмов. При этом образуются гибриды, у которых по сравнению с исходными штаммами наблюдается улучшение или дополнение некоторых свойств: усиление бродильных свойств, изменение хлопьеобразующих свойств, возможность сбраживания более широкого спектра сахаров (в частности декстринов), сбраживание редуцированных сахаров (например, для слабоалкогольного пива), снижение образования или ускоренное расщепление диацетила, устойчивость к токсинам дрожжей-киллеров. Кроме того, в дрожжи могут быть внедрены дополнительные активные ферменты (эндо-β-глюканаза, амилаза, ами-логлюкозидазы и т. д.). Получение гибридов дрожжей может проходить через рамножение (споры) или через неполовой цикл.

Скрещивание путем размножения возможно у дрожжей лишь относительно, так как с учетом их полиплоидии (см. выше) и связанной с этим пониженной склонности к образованию аскоспор они практически не формируют клеток с выраженными типами спаривания. Лишь благодаря мутациям в гене, отвечающем за тип спаривания, можно получить как «исключение» вегетативные клетки пивоваренных дрожжей, способные к спариванию, после чего их можно скрестить с клетками противоположного типа спаривания. Именно на этом основана технология «редкого спаривания». Напротив, неполовой цикл представляет собой соединение вегетативных клеток или протопласт. Другой возможностью является трансформация - внесение генетической информации в материнскую клетку. Применение неполового (соматического) цикла или трансформации позволяет комбинировать наследственную информацию даже различных видов или родов микроорганизмов (в цикле размножения такая возможность отсутствует).

Протопластами являются клетки, стенки которых имеют такой состав ферментов, который обеспечивает их осмотическую лабильность. В гипотонических растворах они разрываются, а в гипертонических растворах сохраняют некоторое время жизнеспособность, принимая шарообразную форму. Регенерация стенки клетки происходит путем введения протопластов в гипертонический питательный агар. Клетка, ставшая после этого вновь полноценной, может вновь размножаться путем почкования. В определенных условиях протопласты способны независимо от их типа спаривания и видовой принадлежности снова сливаться друг с другом. Путем слияния протопластов можно осуществлять скрещивание пивоваренных дрожжей, в том числе пивоваренных дрожжей с дрожжами-киллерами.

Дрожжи-киллеры выделяют токсин, который при содержании дрожжей-киллеров в популяции культурных дрожжей в 1-2% способен подавить жизнедеятельность культурных дрожжей. Хотя такие дрожжи-киллеры не прекращают процесс брожения, пиво приобретает посторонний привкус (например, фенольный - см. раздел 7.4.3.3).

Особенно заметно проявляется вредное действие дрожжей-киллеров в непрерывных системах брожения. В настоящее время отсутствуют достоверные сведения о том, в какой степени при нормальном брожении на пивоваренном производстве дрожжи-киллеры способны инфицировать сусло или нарушать ход процесса брожения.

За выработку дрожжами-киллерами токсина (а следовательно, и за сопротивляемость к нему) отвечают гены, расположенные не в хромосомах ядра клетки, а в так называемой плазмиде-киллере. Эта плазмида является молекулой РНК с двойной спиралью, упакованной в белковую оболочку и присутствующей в 10-12 копиях за пределами ядра клетки в цитоплазме дрожжей-киллеров. Так как гены, отвечающие за поведение дрожжей, расположены на хромосомах ядра клетки (как и гены, которые делают дрожжи-убийцы неприемлемыми в качестве пивоваренных дрожжей, например, из-за образования постороннего привкуса, пониженной способности к брожению, неблагоприятных хлопьеобразующих свойств), то скрещивание пивоваренных дрожжей с дрожжами-киллерами следует проводить только до стадии слияния цитоплазм (плазмогамии), но не слияния ядер (кариогамии). Таким образом, происходит замена только цитоплазматических генов, но не хромосомных. Подобные гибриды в отличие от гибридов с плазмогамией и кариогамией, имеют ядро одного из «родителей» с цитоплазмой, содержащей плазмиды обоих «родителей». У гибридов с ядром клетки пивоваренных дрожжей речь идет о «желаемых» пивоваренных дрожжах-киллерах. Дрожжи с ядром дрожжей-киллеров можно обнаружить и выделить с помощью маркеров. Полученные таким способом «пивоваренные дрожжи-киллеры» обладают свойствами пивоваренных дрожжей, однако при брожении они выделяют активный токсин, служащий защитой против контаминации дрожжами-киллерами. Дрожжи-киллеры (и тем самым пивоваренные дрожжи-киллеры) невосприимчивы к некоторым токсинам отдельных рас дрожжей, например к K₁.

В ходе протопластического слияния или трансформации могут вводиться чужеродные гены - например, β-1,4-глюка-назы из гифомицет. Эндо-ß-1,3- и 1,4-глю-каназы от Bacillus subtilis вносят в пивоваренные дрожжи верхового и низового брожения. При этом бродильная способность дрожжей не меняется, а устойчивость гена ß-глюканазы в дрожжах для низового брожения оказывается лучше, чем в дрожжах для верхового брожения, в частности, для производства эля.

Образование 2-ацетолактата или 2-ацетогидроксибутирата может быть снижено путем редуцирования синтеазы ацетогидроксикислот (прерывания областей кодирования). Повышение активности редуцирующих изомераз и дегид-ратаз может инициировать усиленный приток ацетогидроксикислот к валину или лейцину.

На этих примерах мы хотели показать результаты, уже достигнутые генной инженерией, и показать, каких результатов можно ожидать в ближайшем будущем. До сих пор открытым остается вопрос, не окажут ли эти модификации долговременного воздействия на общее поведение дрожжей, а также вопрос о продолжительности сохранения свойств, внесенных плазмидами. В случае пивоваренных дрожжжей-киллеров проблем в этом отношении пока не выявлено.