Биохимические основы днк- и генно-инженерной технологии в медицине

Достижения в области молекулярной биологии изменяют возможности фармакологической коррекции различных патологических процессов. Эти знания не только углубили представления об экспрессии генов, но и позволили разработать новые подходы к диагностике и лечению ряда заболеваний. В настоящее время доказана взаимосвязь между изменениями в структуре ДНК и некоторыми патологическими процессами. Идентификация генов, нарушение работы которых приводит к развитию наследственных заболеваний, создала предпосылки для развития наиболее эффективных методов их коррекции, лечения и профилактики.

Методами молекулярной биологии и медицины были созданы вакцины для предотвращения гепатита, синтезирован инсулин человека для лечения сахарного диабета, фактор VIII свертывания крови для восстановления нормальных процессов гемостаза и лечения гемофилии, а также другие фармакологические препараты. С помощью генной терапии оказалось возможным встраивать полноценно работающие гены в клетки организма больного и восстанавливать метаболические нарушения, вызванные мутантными генами.

Для выявления дефектов в структуре ДНК, она должна быть выведена из биологической жидкости, биоптата, а также из структуры клеток и «наработана» в количестве, достаточном для лабораторного исследования. Либо с терапевтической целью должны быть выделены гены для введения их в дефектные клетки организма пациента.

Основные методы, используемые при ДНК-диагностике заболеваний:

1. выделение ДНК,

2. расщепление ДНК,

3. идентификация специфических последовательностей в ДНК,

4. блот-гибридизация ДНК,

5. секвенирование ДНК,

6. получение рекомбинантных ДНК и их амплификация.

Выделение ДНК. ДНК может быть выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл с помощью центрифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами, экстрагирование ДНК из раствора. В ходе выделения получают фрагменты ДНК значительно короче исходных. Такие молекулы приходится дополнительно фрагментировать.

Расщепление ДНК с помощью рестриктаз. Рестриктазы – это ферменты, расщепляющие ДНК. Для фрагментирования ДНК используют рестриктазы или рестрикционные эндонуклеазы, полученные из бактериальных клеток. Эти ферменты in vitro расщепляют внутренние участки ДНК на сравнительно небольшие фрагменты. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже из 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК (сайты рестрикции) и «разрезают» ее в местах локализации этих последовательностей.

Известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность. Поэтому с помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть исследованы методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Идентификация специфических последовательностей. При обработке рестриктазами геномной эукариотической ДНК, в частности ДНК человека, образуется много фрагментов различной длины, поэтому их не удается удовлетворительно разделить с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле возможна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Синтез ДНК-зондов осуществляется в автоматизированных машинах, позволяющих синтезировать фрагменты однонитевой ДНК длиной свыше 100 нуклеотидных звеньев со строго определенной первичной структурой. Такие молекулы можно использовать для специфического связывания с исследуемыми участками гена.

Блот-гибридизация по Саузерну. Классическим методом идентификации интересующих участков ДНК стал метод блот-гибридизации по Саузерну, предложенный в 1975 году. Суть метода заключается в том, что сплошная «лестница» фрагментов ДНК, получившаяся в результате деления по молекулярной массе в гелях, подвергается денатурации при температуре 90-95°С для разрыва слабых связей между основаниями двухцепочечной молекулы ДНК с образованием одноцепочечных молекул. Фрагмент ДНК затем переносится с геля на плотный носитель (нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с ДНК- или РНК-зондом, содержащим метку. Методом радиоавтографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридизация – чувствительный метод идентификации ДНК-последовательностей.

Установление первичной структуры ДНК-фрагментов (секвенирование ДНК). Наиболее часто для установления первичной структуры ДНК используют дидезоксисеквенирование. В реакционных пробах, содержащих денатурированную однонитевую ДНК, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ, один из которых является радиоактивным), и праймер инициируют синтез ДНК в присутствии специфических дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддНТФ), или терминаторов, – ддАТФ, ддЦТФ, ддГТФ или ддТТФ. Синтез одновременно ведут в четырех параллельных пробах, в каждую из которых наряду с компонентами реакционной смеси прибавляют один из 4 ддНТФ.

ДдНТФ будут конкурировать с нормальными дНТФ за включение в растущую полинуклеотидную цепь. При встраивании ддНТФ вместо соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается. Затем устанавливают последовательность нуклеотидов во вновь синтезированных фрагментах, комплементарных ДНК-матрице.

Секвенируемый фрагмент ДНК метят по фосфатному остатку. Фрагмент ДНК гибридизируется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Таким образом, определяется набор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в исследуемом фрагменте ДНК. Далее при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение октамеров в исследуемом фрагменте ДНК.

Получение рекомбинантных ДНК и их амплификация. Исследуемые фрагменты ДНК обычно предварительно амплифицируют (увеличивают количество в миллионы раз), для того чтобы получать их в любое время и в неограниченном количестве. Исключительно ценным инструментом в решении этой проблемы оказалось использование рекомбинантных ДНК (т.е. ДНК, построенных из участков разного происхождения).