Радиоиммунологический анализ

Радиоиммунологический анализ относится к вариантам радионуклидного сатурационного анализа.

Основной принцип РИА-диагностики. Экспериментальная система в радиоиммунологическом анализе содержит три основных компонента: лиганд (определяемое вещество, называемое обычно «антиген», хотя этот термин достаточно условный, поскольку далеко не всегда происходит реакция именно антиген-антитело в иммунологическом смысле), меченный радионуклидом лиганд и антитело, связывающее меченый и немеченый лиганды. РИА-диагностика основана на специфической иммунохимической реакции антигена с антителом при конкуренции с меченым антигеном. Количество связавшегося антителом радиоактивного лиганда в системе в момент насыщения обратно пропорционально количеству нерадиоактивного.

Вместе с собственно РИА-диагностикой под термином РИА часто объединяют (что достаточно некорректно) и несколько других разновидностей радионуклидного анализа, отличающихся по своим характеристикам:

1. Если метить не лиганд, а антитело и использовать методы разделения комплексов антитело-лиганд от свободных антител, то также можно определить содержание лиганда в пробе. Данный методический подход получил название иммунорадиометрического анализа (ИРМА).

2. Позже вместо антител стали использовать естественные белки плазмы или тканей, которые обладают специфическим сродством к определяемому веществу. На основе такого подхода разработан радиоконкурентный анализ (РКА), иначе - метод конкурентного белкового связывания (КБС).

3. Методика использования тканевых рецепторных белков вместо антител для специфического связывания лигандов позволила осуществить разработку радиорецепторного анализа (РРА).

4. Существует также радиоэнзиматический анализ (РЭА) – методический подход, при котором в качестве связывающего агента для определяемого вещества и его меченого аналога используют специфический фермент.

Благодаря точности, надежности, высокой специфичности и чувствительности (10^-15-10^-12 г/л), простоте выполнения методы РИА получили широкое распространение. Применение высокоспецифичных антител к анализируемому веществу в сочетании с изотопной меткой позволяет с высокой чувствительностью определять практически неограниченно широкий круг веществ, на что в ряде случаев требуется лишь несколько капель крови, другой биологической жидкости или экстракта. Тест-системы для радиолигандного анализа выпускаются в виде коммерческих РИА-наборов (radioimmunoassay kit), укомплектованных всем необходимым для проведения исследования. С помощью наборов возможно количественное и качественное определение широкого спектра соединений в различных средах организма, биологических экстрактах.

Многие вещества, исследуемые с помощью РИА, сложно определить биохимическим способом в смеси с другими, часто похожими, соединениями.

Необходимые компоненты РИА-набора:

1. Метка. В качестве радиоактивной метки используются ¹²⁵I и ³Н. Применение этих изотопов различно и определяется их свойствами. ³Н прекрасно хранится, но энергия образующихся при его распаде β-частиц очень мала, поэтому для регистрации излучения необходимо растворять радиоактивное вещество в жидком сцинтилляторе. При использовании нуклидов ¹²⁵I не нужны сцинтилляторы, но невозможно длительное хранение изотопа из-за относительно короткого периода полураспада. Таким образом, выбор изотопа определяется задачами исследования.

При РИА-диагностике радионуклид применяется исключительно в виде комплекса с «антигеном» (удельная активность – 100 мкюри/мг), т.к. принцип радиолигандного метода подразумевает конкурентное взаимодействие молекул определяемого вещества и его меченого аналога со связывающим агентом, то. При выполнении процедур РИА используется «тотальная проба», которая содержит только метку и характеризует ее активность.

2. Стандарты. Это четко отмеренные количества определяемого вещества для построения калибровочного графика, в том числе присутствует нулевой стандарт. Обычно используется пять или шесть стандартов. В каждом отдельно взятом наборе в качестве метки и стандарта выступает один и тот же «антиген», с той лишь разницей, что в состав стандарта радиоактивная метка не входит. Используя стандартные растворы, можно построить калибровочную кривую и по ней определить содержание лиганда в опытных пробах. Необходимое условие качественного выполнения анализа – одновременное выполнение трех параллельных проб для каждого стандарта.

3. Связывающий агент. Он выступает в качестве предмета конкуренции между меткой и стандартом или определяемым веществом. По аналогии с «антигеном» здесь традиционен термин «антитело» (или «антисыворотка»), хотя при таких вариантах сатурационного анализа, как ИРМА, РРА в этом качестве выступают белки, тканевые рецепторы и т.д.

При выполнении радиоиммунологического анализа используется проба на неспецифическое связывание, которая содержит все компоненты набора, кроме антитела, и позволяет определить неспецифическое связывание метки с разделяющими компонентами и стенками пробирки.

4. Система разделения иммунных комплексов и свободных лигандов. Она предназначена для сепарации образовавшихся комплексов «антиген-антитело» от непрореагировавших между собой компонентов смеси. В разных наборах используются различные варианты методов разделения:

1. метод двойных антител или «сэндвич-метод» (вторичные антитела простые в растворе без носителя, или антитела, ковалентно фиксированные на подвижной твердой фазе – гранулированных частицах сефарозы, целлюлозы, сефадекса, стекла);

2. иммобилизованные антитела (связывающий реагент иммобилизован с помощью ионных, гидрофобных сил на дискообразных частицах полимеров или на стенках полимерных пробирок);

3. фракционное осаждение (полиэтиленгликоль, сульфат аммония, сульфит натрия, этанол, диоксан и др.);

4. адсорбция (активированный уголь, силикаты, гидроксиапатит);

5. гель-фильтрация (добавление геля в пробирку, на современном этапе колонки не используются).

В настоящее время чаще всего для анализа используют наборы второго поколения, где применяются различные варианты твердофазного РИА, при котором антитела фиксированы на иммуносорбентах – «твердой фазе» или на стенках одноразовых пробирок и можно обойтись без центрифугирования.

Порядок проведения РИА-диагностики. Методические детали и особенности проведения радиоконкурентного анализа описаны в инструкциях фирм-изготовителей для каждого РИА-комплекта. Радиоиммунологический анализ подразумевает следующие основные этапы:

1. Внесение в пробирку: исследуемой пробы или раствора стандарта, меченого антигена, антисыворотки или другого специфического связывающего компонента в присутствии буфера.

2. Инкубация проб в оптимальных для каждого набора условиях, что необходимо для установления динамического равновесия между процессами образования и распада иммунных комплексов. Длительность инкубации зависит от молекулярной массы реагирующих антигенов и температуры, при которой происходит реакция.

3. Сепарация связанной и свободной фракций меченого лиганда одним из методов разделения (фракционное осаждение, адсорбция и др.) с последующим центрифугированием и аспирацией или декантированием супернатанта. В случае применения твердофазных вариантов РИА процесс разделения иммунных комплексов и свободных лигандов упрощается.

Заключительными этапами РИА являются:

1. Радиометрия одной из полученных фракций. В некоторых РИА-наборах осаждается не комплекс антиген-антитело, а свободный лиганд, поэтому в таких наборах определяется радиоактивность не осадка или иммобилизованного комплекса, а надосадочной жидкости.

2. Построение калибровочной кривой по результатам измерений стандартных проб. Калибровочный график отражает зависимость между величиной радиоактивности связанного (или свободного) лиганда и количеством введенного немеченого аналога. Стандартная кривая может быть построена несколькими способами, но во всех случаях по оси ординат откладывается процент связывания, а по оси абсцисс – концентрации стандартов.

К каждому поставляемому РИА-набору фирма-производитель обычно прилагает калибровочный график, выполненный на момент приготовления реактивов, в том числе и метки. Калибровочная кривая, построенная в лаборатории при проведении РИА-анализа, всегда имеет отклонения от первичного графика (угол наклона и др.), обусловленные не столько периодом полураспада радиоактивной метки, сколько степенью сохранения иммунореактивности меченого лиганда. Его молекулы с течением времени деградируют вследствие радиолиза. Антитело перестает «узнавать» свой видоизмененный антиген: образование комплексов антиген-антитело резко снижается. Чем ниже величина связывающей способности антитела, тем ниже чувствительность тест-системы, поскольку калибровочная кривая будет более пологой. Дополнительный вклад в модификацию кривой вносит снижение радиоактивности метки в процессе транспортировки и хранения набора. Вследствие этих причин нельзя пользоваться первичной калибровочной кривой. Для обработки результатов необходимо иметь кривую, отражающую состояние реагентов на момент выполнения анализа.

3. Расчет концентрации определяемого вещества в анализируемых пробах – путем сравнения степени редукции связывания меченого соединения в пробах и стандартах. Конечные результаты выражают в единицах, рекомендованных фирмами-изготовителями тест-наборов для построения калибровочных кривых из стандартных навесок определяемых веществ.

Радиометрию проб и математическую обработку информации (перевод числа импульсов счета каждой пробы в единицы концентрации с учетом калибровочных проб) проводят на γ-счетчиках, γ-спектрометрах, β-сцинтилляционных счетчиках, снабженных пакетом прикладных программ компьютерной обработки данных.

Наиболее часто с помощью РИА-методов определяют стероидные и белково-пептидные гормоны, тропные гормоны гипофиза, опухолевые антигены, иммуноглобулины, транспортные белки крови, витамины, многие ферменты, лекарственные вещества, простагландины, опиоидные пептиды, циклические нуклеотиды и другие биологически активные вещества.