Иммунохимические методы в клинической лабораторной практике
Особый интерес к иммунохимическим диагностическим тестам появился после разработки методов анализа биологически активных веществ, известных под названием «методов связывания», из которых наиболее популярными и перспективными являются радиоиммунологический (РИА) и иммуноферментный (ИФА) методы. С их помощью в лабораториях определяют широкий спектр показателей, используемых различных областях медицины:
в эндокринологии для диагностики сахарного диабета, патологии гипофизарно-надпочечниковой и тиреоидной систем, изучения механизмов эндокринно-обменных нарушений;
в онкологии для ранней диагностики злокачественных опухолей и контроля за эффективностью лечения;
в кардиологии для диагностики ОИМ и дифференциации форм сосудистых нарушений;
в педиатрии для определения причин нарушений развития у детей и подростков;
в акушерстве и гинекологии для контроля за развитием плода, диагностики гинекологических заболеваний и выявления причин бесплодия;
в аллергологии для определения концентрации иммуноглобулинов и аллергенов;
в психиатрии для оценки эффективности лечения и т.д.
В основе этих методов лежит сатурационный (saturation – насыщение) заместительный анализ. Он основан на конкуренции немеченых («холодных») молекул определяемого биологического вещества и молекул этого же вещества, соединенных с меткой, за связывание специфическими биндинг-системами. В качестве связывающих систем используют антитела, специфические транспортные белки или рецепторные белки органов-мишеней. Немеченое вещество и его меченый аналог конкурируют за лиганд, используемый в количестве, достаточном для полного насыщения его связывающей способности. После отделения комплекса от свободных ингредиентов подсчитывают количество несвязанной метки или метки в составе комплекса.
В сатурационном анализе в качестве метки может быть использован радиоактивный нуклид (125I, 3H и др.), применяются также флюоресцентные, ферментные, свободнорадикальные метки.
Иммуноферментный метод исследования
Иммуноферментный анализ относится к фотоколориметрическим и иммунологическим методам исследования в комплексном исполнении.
Проведение иммуноферментного анализа.
Самой распространенной модификацией иммуноферментного анализа является твердофазный иммуноферментный метод. Существуют два основных вида твердофазного анализа:
классический «сэндвич» – способ для обнаружения антигенов в биологических жидкостях, основной принцип метода заключается в последовательности иммуноферментных реакций.
Общая схема «сэндвич»-метода:
(полистирен – антитело) (антиген) (антитело – фермент)
(полистирен – антитело – антиген – антитело – фермент)
(полистирен – антитело – антиген – антитело – фермент) (субстрат)
(полистирен – антитело – антиген – антитело – фермент – субстрат)
гетерогенный метод для обнаружения антител и аутоантител в биологических жидкостях. Используется аналогичный принцип последовательного связывания; разница заключается в том, что на твердофазной подложке фиксируется антиген, взаимодействующий в последующем с аутоантителами, конъюгированными с ферментом (пероксидазой). Гетерогеный ИФА иначе называют ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) – ферментсвязывающий иммуносорбентный анализ.
При разделении связанного и свободного меченого антигена (антитела) в качестве твердофазной подложки для закрепления антигена (антитела) могут использоваться нерастворимые носители из полистирена, целлюлозы, сефадекса, сефарозы, агарозы, латекса и других материалов, или же поверхность пробирок, лунок планшетов, микроплат из полистирена, силиконовых трубок.
Чаще всего, тот и другой методы ИФА заключаются в высококонтактном связывании антител с поверхностью планшета разового использования, в результате чего лунка планшета приобретает свойства антительного сорбента, способного извлекать из биологических жидкостей исследуемое вещество. В качестве антительного сорбента используются преимущественно полистироловые планшеты для иммунохимических исследований (коммерческие, типовые, имеющие соответствующий ГОСТ), поскольку полистирен эффективно адсорбирует антитела. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело» выявляется с помощью тех же антител, конъюгированных с ферментом. В качестве ферментной метки используют пероксидазу из корня хрена, щелочную фосфатазу, глюкозооксидазу, β-галактозидазу.
Регистрация результата исследования.
Активность фермента оценивается с помощью цветной реакции. Например, активность пероксидазы из корня хрена по реакции с хромогенным субстратом (тетраметилбензидин). Интенсивность окраски пропорциональна концентрации субстрата реакции в образце.
Ферментативная активность регистрируется на одно- или многоканальном («мультискан») планшеточном иммуноферментном анализаторе-спектрофотометре (например, «DUNEX» с длиной волны 450 нм) по степени изменения окраски субстратной смеси. Количественную оценку проводят по калибровочной кривой графическим методом (как на фотоколориметре). Тест-системы высоко специфичны и позволяют определять количество исследуемых веществ в концентрации 10-20 нг в 1 мл и выше.
Контроль качества.
Избранные точки калибровочной кривой и значение контрольного образца должны попасть в диапазон значений оптической плотности, концентрации и коэффициента вариации, указанных в паспорте контроля качества.
Иммунохимические методы исследования интенсивно развиваются и используются не только для решения фундаментальных проблем иммунологии, белковой химии, эндокринологии, генетики, но и для решения практических задач различных областей медицины, особенно тех, в которых необходимы точные количественные методы определения содержания биологически активных макромолекул.
В настоящее время проведена клиническая апробация твердофазных иммуноферментных методов количественного определения гормонов, миоглобина, фибриногена, продуктов деградации фибрин-фибриногена, фибронектина, иммуноглобулинов класса Е, аутоантител к миоглобину, инсулину и т.п. При этом фирмами-производителями оценивается клиническая и серо-эпидемиологическая целесообразность применения разработанных диагностикумов.
Разрабатываются серии ИФА-диагностикумов для комплексной оценки функционирования отдельных органов и систем организма, разностороннего подхода к обследованию пациента не только на этапе установления точного диагноза, но и при проверке эффективности лечебных воздействий. Приводим один из рекомендуемых комплексов тест-систем для иммуноферментного определения уровня тиреоидных гормонов при патологии щитовидной железы:
тиреотропный гормон (Юни – Тест – ИФА – ТТГ),
общий тироксин (Юни – Тест – ИФА – ТГ4),
свободный тироксин (Юни – Тест – ИФА – ТГ3),
тиреоглобулин (Юни – Тест – ИФА – ТГ),
антитела к тиреоглобулину (Юни – Тест – ИФА – АТ – ТГ),
антитела к микросомальной фракции щитовидной железы (Юни – Тест – ИФА – АТ – МФТ).