3. Секвенирование полного генома человека

Созданию высокоэффективных методов определения и расшифровки нуклеотидной последовательности ДНК-секвенирования — способствовало появление возможности клонирования целевых фрагментов ДНК в составе векторов и наработка их в требуемых количествах. Это привело к бурному развитию генетической инженерии (или технологии рекомбинантных ДНК), которая разделяется на две большие области исследования — методы клонирования ДНК и методы анализа ДНК (секвенирования).

Клонирование ДНК in vitro включает этапы:

1. получение фрагментов ДНК, в том числе генов и их частей с помощью ферментов рестрикции;

2. рекомбинация фрагментов;

3. вставка фрагментов ДНК в вектор (фаг, плазмида, космида и т. д.);

4. трансформация организма хозяина с помощью вектора;

5. отбор клонов, интересующих исследователя.

Секвенирование ДНК заключается в определении последовательности нуклеотидов во фрагменте. Эта процедура позволяет расшифровать структуру гена, установить природу мутаций в нем, определить аминокислотную последовательность в молекуле белка, кодируемую этим геном на основе генетического кода, и т. д. Наиболее распространенным методом секвенирования является дидезокси-метод Ф. Сенгера: для терминации синтеза цепи ДНК при этом используют дидезоксинуклеотиды dATP, dCTP, dGTP и dTTP.

Ручные методы секвенирования не позволяли справляться с большим объемом работ, поэтому возрастающие масштабы получения информации о последовательности нуклеотидов ДНК у разных видов организмов привели к созданию систем автоматизации. В 1987 г. фирмой Applied Biosystems (США) был создан первый автоматический ДНК-секвенатор. Такие роботы-секвенаторы управляются с помощью специально созданных компьютерных программ сбора и анализа данных. Каждый год такие автоматы совершенствуются, они превосходят человека по производительности. Процесс секвенирования становится простой процедурой и проводится в любой молекулярно-биологической лаборатории.

«Черновой» (первый) вариант генома человека

Из всего генома секвенировано около 90 % последовательности нуклеотидов в эухроматических районах хромосом, для которых характерна слабая степень окрашивания красителем Гимза и флуорохромами. Размер этой части составляет 2,9 млрд п. н. Наибольшие методические трудности при секвенировании показали следующие участки, остающиеся нерасшифрованными:

• саттелитная ДНК теломерных и околоцентромерных районов хромосом;

• сильно спирализированные области интеркалярного (внутрихромосомного) гетерохраматина, способные ярко окрашиваться красителем Гимза и флуорохромами;

• небольшие интерстициальные фрагменты гэпы (gaps).

Установлено, что только около 1,2 % всей ДНК генома кодирует структуру белков и РНК, а более 80 % ее длины представляют собой повторяющиеся нуклеотидные последовательности разной длины, которые не транскрибируются. На основе сравнительного компьютерного анализа геномов домовой мыши и человека было высказано предположение о том, что в повторяющихся участках геномной ДНК возможно закодирована информация, связанная с программой онтогенеза. Общее количество однонуклеотидных замен SNP достигает 3,2 млн на геном, причем почти половину из них (~ 1,5 млн.) составляет смысловую (экспрессирующуюся) часть генома. Они играют важную роль в генетическом полиморфизме человека, в различиях рас и этносов, отдельных индивидов, в молекулярной диагностике наследственных болезней. Общее число генов человека оценивается 31-38 тыс., из них идентифицировано 22-26 тыс., а на индивидуальных хромосомах картировано 14.065 генов. К 2003 г. идентифицированы, клонированы in vitro и изучены на присутствие мутаций гены всех наиболее распространенных наследственных заболеваний.

Размер генома оценен в 3.164,7 млн п. н. Гены сильно отличаются друг от друга по размерам. Усредненная длина гена человека составляет около 30 тыс. п. н. (содержит 9 экзонов и 8 интронов). Самый большой ген белка миодистрофина имеет размер 2,7 млн п. н. (этот белок обеспечивает устойчивость и эластичность мышечных волокон при сокращениях). Самые короткие гены содержат два десятка нуклеотидов, например, гены эндорфинов — полипептидов, вызывающих ощущение удовольствия. О функциях почти половины всех генов ничего не известно; многочисленные повторяющиеся последовательности нуклеотидов не кодируют белки, но играют важную роль в поддержании структуры и функции хромосом и генов. Светлые участки хромосом, обогащенные GC-парами, содержат много генов, тогда как участки темно окрашенные, богаты АТ-блоками и содержат мало генов. Области генома с кодирующими участками (генами) отделены друг от друг а протяженными участками некодирующей ДНК. Структурные (смысловые) гены отделены от бессмысленной «эгоистической» ДНК протяженными последовательностями из GC-пap длиной около 30 тыс. п. н. которые регулируют функциональную активность генов.

Показано, что у человека синтезируется во много раз количество белков, чем у нематоды и дрозофилы. Это объясняется особенностями транскрипции генов, химической модификации белков и сплайсинга, когда с одного гена можег считываться информация о синтезе нескольких белков с различными функциями. Несмотря на большое сходство белков человека с белками нематоды, дрозофилы и даже растений, для человека более характерны многочисленные и разнообразные семейства белков, ответственных за процессы раннего онтогенеза и иммунитет. Из 1278 семейств белков, закодированных в геноме человека, позвоночным животным свойственны 94 семейства. Проблемы идентификации генов в секвенированных последовательностях генома показали, что наши представления о структуре генов и их регулирующих элементах явно недостаточны и неполны.

Представляет интерес плотность генов в просеквенированных геномах разных видов, т. е. число генов на участке 10⁶ п. н. У пекарских дрожжей эта величина равна 483 гена, у нематоды — 197, у дрозофилы — 117, у резуховидки (Arabidopsis) — 221 ген. У человека в хромосоме 21 это число 7 генов, в хромосоме 16 — 16 генов, а в среднем в секвенированной части генома — 12 генов. Некоторое количество генов по-видимому получено человеком от бактерий в результате горизонтального переноса. Очевидно бактериальный геном мог служить прямым донором генов для позвоночных. У человека, по сравнению с другими просеквенированными видами, чаще имеет место альтернативный сплайсинг в генах, т. е. для образования молекул функциональной мРНК реализуется больше путей объединения экзонов.

Секвенирование генома человека позволило провести сравнение физических и генетических карт по 5282 полиморфным локусам, положение которых по длине хромосом определено в сантиморганидах и в миллионах пар нуклеотидов. Средняя частота рекомбинаций (кроссинговера) возрастает по мере уменьшения длины хромосомных плеч. Средняя частота рекомбинаций в длинных плечах составляет 1 сМ, а в наиболее коротких — 2 сМ на 1 млн п. н. Частота рекомбинации уменьшается вблизи центромер, а в терминальных участках размером 20-35 млн п. н. возрастает. Это явление наиболее заметно на мейотической карте хромосом у мужчин, в частности, в псевдоаутосомной области хромосом X и Y. Физический размер этой области составляет 2,6 млн п. н., а ее генетическая длина достигает 50 сМ. В результате кроссинговер в этой области происходит практически в каждом акте мейоза, т. е. частота рекомбинации превышает среднее значение более чем в 20 раз.

В последнее время большой интерес проявляется к альфа-сателлитным ДНК, установленных в геномах всех приматов и человека. Их анализ является необходимым этапом на пути изучения эволюции хромосом. Они представляют собой тандемно повторяющиеся последовательности ДНК с элементарной единицей длиной 171 п. н. (Казаков, 2000). Все альфа-сателлиты гибридизируются между собой и имеют степень гомологии около 60%. Альфа-сателлиты расположены в участках центромерного хроматина всех хромосом человека, где они занимают крупные блоки длиной от 200 до 5000 тыс. п. н. Такие блоки обнаружены и в других участках хромосом. Альфа-сателлитные последовательности человека имеют сложную трехуровневую организацию и играют важную роль в организации центромеры и определении ее функции в процессе митоза.

К настоящему моменту точность определения генов на неизвестной нуклеотидной последовательности компьютерными методами не превышает 70 %. Знание полных геномов дает возможность осуществить их исчерпывающий анализ, что позволит описать виды организмов на разных уровнях. Развитие в этой области проходит очень успешно, поэтому высказываются шутливые опасения насчет ближайшего будущего: через несколько лет будет выяснено всё, что только можно выяснить, и делать уже будет нечего (Александров, Дроздов-Тихомиров, Шепелев, 2004).

«Геномизация» человечества

Расшифровка генома человека и других видов спровоцировала создание и интенсивное развитие совершенно новых направлений биологии, теории эволюции, генетики, антропологии, медицины, фармакологии и лингвистики. В отличие от классической молекулярной биологии и генетики, геномика имеет колоссальный диапазон воздействия на сопределенные науки, на общество в целом, включая биоэтические проблемы, а также социальную концепцию Русской Православной Церкви. Все это позволило внести новый аспект рассмотрения методологических и практических достижений геномики, влияющих на социальную и интеллектуальную жизнь современного человека, придав ему интригующее название «Геномизация человечества» (Баранов, Киселев, 2005). Связанный с геномикой неиссякаемый объем информации позволяет надеяться, что естесвознание стоит в преддверии получения ответа на извечный вопрос: «Что такое жизнь?» (Свердлов, 2003). Необходимо дать краткое изложение основных направлений исследований, возникших недавно под влиянием достижений геномики.

Сравнительная геномика использует методы анализа молекулярных механизмов путем сравнения геномов разных видов, их генов и генных продуктов в разных органах и тканях. Изучение действия генов в геномах разных видов основано на признании того, что жизненно важные регуляторные функции в ходе эволюции сохранились у организмов далеко отстоящих таксономически групп. Самые элементарные клеточные функции, такие как базовый метаболизм, репликация ДНК, транскрипция, трансляция остались консервативными со времени расхождения одноклеточных дрожжей и бактерий. Но консервативность распространяется на значительно большее число генов. В сумме 60 % из предсказанных белков человека имеют сходство с белками других видов, геномы которых просеквинированы. Информация о регуляции клеточного цикла у млекопитающих получена путем сравнения с аналогичным процессом у дрожжей. Сравнительный компьютерный анализ геномов инициирует создание универсальной системы классификации живых организмов, своего рода «Периодическую систему геномов», аналогичную Периодической системе химических элементов Д. И. Менделеева. Французский математик Андри Пуанкаре (Пуанкаре, 1983) в качестве естественной предложил понимать параметрическую систему, в которой положение объекта задается одним (как число протонов в системе Менделеева), двумя (как координаты на географической карте) или несколькими параметрами.

Транскриптомика нацелена на масштабный анализ всех мРНК, кодирующих белки, и выяснение того, где, когда и в каких условиях транслируются разные гены. Изучается координированная работа генов, образование первичных транскриптов, процессы сплайсинга и формирования зрелых мРНК. Исследование «транскриптома» методом микрочипов дает возможность установить различия между экспрессией генов в разных тканях, проанализировать характер экспрессии в разные периоды болезни, классифицировать белки секретируемые и связанные с мембранами на основе положения их мРНК.

Задачей протеомики является исследование синтеза и функций набора белков в разных клетках на разных стадиях развития организмов. При этом охватываются все синтезируемые в клетке белки, выясняется их строение, количество, локализация. Кроме первичной структуры, другой задачей протеомики является предсказание пространственного сворачивания (фолдинга) белка по его аминокислотной последовательности, так как функционирование белков зависит от их пространственной структуры. В настоящее время из более 30 тыс. генов на физической карте генома человека функционально изучены 11 тыс. генов. Предполагается, что выяснение функций всего генома человека позволит идентифицировать в протеоме 200-300 тыс. белков. В 2002 г. создан проект «Протеом плазмы крови» с участием 35 лабораторий из 13 стран. Методом масс-спектроскопии было идентифицировано 9504 белка. Быстро развивается также протеомика тромбоцитов, отвечающих за свертывание крови.

С протеомикой непосредственно связаны исследования обмена веществ в клетке — метаболизма. Это направление названо метаболономика, в задачи которой входит выявление и моделирование структуры метаболизма, обеспечивающего поддержание гомеостаза в клетке за счет регуляторных свойств ферментов и функционирования генома. В свою очередь, устойчивый метаболизм, как замкнутая система согласованно протекающих биохимических реакций, обеспечивает считывание и реализацию генетической информации, а через них — собственное воспроизведение. Эти исследования о жизни клетки, отраженной в структуре и динамике ее метаболизма, являются менее разработанными, но не менее важными, чем исследования генетической информации.

Практический потенциал «геномизации» жизни человечества наиболее ярко проявляется в биомедицинских исследованиях, где интенсивно развивается новый раздел медицинской науки — геномная (молекулярная) медицина. Большие успехи достигнуты в идентификации генов моногенных заболеваний, наследование которых подчиняется законам Менделя. Это относится к генам, ответственных за муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы), рак молочной железы, другие виды наследственной предрасположенности к опухолям, мышечной дистрофии Дюшенна; ген, ответственный за преждевременное старение (синдром Вернера); гены, ответственные за нейрофиброматоз, и др.

Более распространены и наносят больший экономический ущерб обществу сложнонаследуемые (мультифакториальные) заболевания, не подчиняющиеся менделеевским законам наследования: атеросклероз, гипертония, психиатрические заболевания, диабет, ревматоидный артрит и др. В результате достижений геномики расширились возможности изучения этой многочисленной группы болезней.

Изучение генетического полиморфизма в отношении восприимчивости к лекарствам привело к возникновению еще одного направления — фармакогеномики (фармакоантропологии), объединяющей генетический полиморфизм фармакокинетических и фармакодинамических процессов. Современная медицина для лечения пациентов опирается на популяционностатистические данные, без учета индивидуальных особенностей. Поэтому в задачи фармакогеномики входит систематизация вариабильности генов, контролирующих реакции организма на условия среды, а также на действие лекарственных препаратов. К ним относится большая группа генов:

• контролирующих метаболизм ксенобиотиков;

• репарацию нуклеиновых кислот;

• контроль клеточного цикла;

• контроль программируемой клеточной смерти, и др.

Сюда же примыкает проблема генетических межэтнических различий в восприимчивости к лекарствам.

Накапливается все больше данных в пользу того, что к генетически детерминированным личностным особенностям относятся уровень интеллекта (показатель IQ), самостоятельность и зависимость, активность и пассивность, мнительность и тревожность, экстравертность и интровертность, чувствительность или толерантность к стрессам, альтруизм и эгоизм, агрессивность или сексуальность (Бельков, 2007).

Геномная медицина ускорила открытие механизмов возникновения и развития многих патологий. В ближайшем будущем можно ожидать, что единая медицинская наука раскроет молекулярные механизмы патологий и объединит их в систему взаимодействий:

Гены (ДНК) —► РНК —► Белки —► Метаболиты —► Физиологические процессы —► Психические и психиатрические особенности —► Ментальные и интеллектуальные характеристики

Геномика по-новому поставила проблему происхождения человека и его эволюции. В этногеномных исследованиях установлены генетические маркеры, различающиеся у разных рас, этнических групп и народностей, что внесло новые веяния в этнографию, археологию и лингвистику. Этногеномика — это своеобразный мост между естественными и гуманитарными науками. Человек разумный как биологический вид сформировался около 200 тыс. лет назад. Секвенирование генома человека позволило образно представить длинную историю человечества как бы записанной в геноме Homo sapiens, а по геномным маркерам достаточно реально проследить миграции народов.

К этногеномике вплотную примыкает палеогеномика, которая позволяет реконструировать события давнего прошлого, например, охарактеризовать геном вымершего ближайшего родственника современных людей — человека неандертальского Homo neanderthalensis.

На основе медицинской геномики создана молекулярная диагностика наследственных болезней, их прогнозирование и генотерапия. Возможности генной диагностики расширились в результате картирования однонуклеотидных замен (полиморфизмов SNP). Идентифицированы гены, с которыми связана этиология более чем 6 тыс. наследственных болезней. Диагностические центры широко применяют в своей практике молекулярные методы:

• для диагностики генных болезней;

• для выявления гетерозиготного носительства патологических мутаций в семьях высокого риска;

• досимптоматической диагностики болезней с поздней манифестацией;

• для идентификации личности (геномная дактилоскопия).

Используются также результаты исследования генов предрасположенности и бессимптомного носительства мутаций генов наиболее частых наследственных болезней (гемофилия, муковисцидоз, фенилкетонурия и др.), информация о кариотипе пациента. На основе тестирования в Лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН (Санкт-Петербург) разработан «генетический паспорт», упрощенным вариантом которого является персональная генетическая форма.

Для интерпретации результатов в медицинской практике используется компьютерная программа SESAM (Франция). Она дает возможность врачу-генетику получить объективную информацию о предрасположенности субъекта к тому или иному заболеванию, судить о его медицинском прогнозе, аргументировано проводить медико-генетическое консультирование.

Проникновение биотехнологии и геномики в медицинскую практику ускорило создание биоэтики и этических принципов деятельности генетической службы. Они сформулированы в рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ. Женева. 16 сентября 1997 г.). В нашей стране разработан законопроект «О генно-инженерной деятельности» применительно к человеку. Большое значение имеет оценка биоэтических проблем в послании «Социальная концепция Русской Православной Церкви» (2000), где дается оценка основным направлениям прикладной геномики и репродуктивной медицины и их совместимости с Православием.